أغماد الذرة المنفصلة لتصوير الخلايا الحية للعدوى بمسببات أمراض الذرة الورقية الفطرية

Summary

تفصل هذه المخطوطة بروتوكول التلقيح الأمثل الذي يستخدم أغماد أوراق الذرة المنفصلة للدراسات الخلوية والفسيولوجية والجزيئية القابلة للتكرار لتفاعلات الذرة مع مسببات الأمراض النباتية الفطرية. تسهل أغماد الأوراق المراقبة في الوقت الفعلي للتفاعلات الخلوية بين النبات الحي والفطريات في الأنسجة غير الثابتة.

Abstract

لقد قمنا بتحسين بروتوكول لتلقيح أغماد أوراق الذرة بالفطريات المسببة للأمراض الورقية ذاتية التغذية والميتة. تم تعديل الطريقة من طريقة تم تطبيقها في الأصل على أغلفة أوراق الأرز وتسمح بالمراقبة المجهرية المباشرة لنمو الفطريات وتطورها في الخلايا النباتية الحية. يتم تلقيح أغماد الأوراق التي يتم جمعها من شتلات الذرة مع اثنين من أطواق الأوراق الناشئة بالكامل بقطرات 20 ميكرولتر من 5 × 10⁵ جراثيم / مل معلقات جراثيم فطرية وحضنها في غرف الرطوبة عند 23 درجة مئوية تحت ضوء الفلورسنت المستمر. بعد 24-72 ساعة ، تتم إزالة الأنسجة الزائدة بشفرة حلاقة لترك طبقة واحدة من خلايا البشرة ، وهي عينة واضحة بصريا يمكن تصويرها مباشرة دون الحاجة إلى التثبيت الكيميائي أو التطهير. تبقى الخلايا النباتية والفطرية على قيد الحياة طوال مدة التجربة ويمكن تصور التفاعلات في الوقت الفعلي. يمكن تلطيخ الأغماد أو تعريضها لانحلال البلازما لدراسة علم الخلايا النمائي وصلاحية الخلايا المضيفة والممرضة أثناء العدوى والاستعمار. يمكن تلقيح السلالات الفطرية التي تم تحويلها للتعبير عن البروتينات الفلورية أو تلقيحها بشكل مشترك على الأغماد لزيادة الدقة ولتسهيل تقييم التفاعلات التنافسية أو التآزرية. يمكن استخدام السلالات الفطرية التي تعبر عن بروتينات الاندماج الفلورية لتتبع وقياس إنتاج واستهداف هذه البروتينات الفردية في لسان النبات. يمكن استخلاص أنسجة الغلاف الملقحة لتوصيف الأحماض النووية أو البروتينات أو الأيضات. أدى استخدام مقايسات الغمد هذه إلى تقدم كبير في الدراسات التفصيلية لآليات الإمراضية الفطرية في الذرة وكذلك مستجيبات البروتين الفطري والمستقلبات الثانوية التي تساهم في الإمراضية.

Introduction

تعتبر التحليلات المكانية والزمانية على المستوى الخلوي ضرورية لفهم فسيولوجيا وعلم الخلايا للتفاعلات الفطرية النباتية. تم استخدام الأنسجة الورقية التي تم تثبيتها كيميائيا¹،²،³أو تطهيرها وتلوينها⁴ ، وكذلك الأغشية الاصطناعية^{5 ،} في الماضي للتحقيق في علم الخلايا لتطور مسببات الأمراض الورقية والتفاعلات الفطرية النباتية. ومع ذلك ، فإن التحقيق في أحداث العدوى في أنسجة المضيف الحي في الوقت الفعلي دون تثبيت أو إزالة يمثل تحديا بسبب المشكلات الفنية المتعلقة بإعداد عينات شفافة بصريا للتصوير.

تم تطوير بروتوكول تلقي....

Protocol

ملاحظة: يظهر سير العمل الخاص بالأسلوب في الشكل 1.

الشكل 1: خطوات بروتوكول التلقيح الأمثل باستخدام أغلفة أوراق الذرة المنفصلة. يتم تمييز تحضير تعليق البوغ ، وتلقيح غمد الأوراق ، وإعداد العينة للفحص المجهري للخلايا الحية في مربعات خضراء (A) وأرجوانية (B) وبرتقالية (C) ، على التوالي. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com.

النتائج

تصف الأمثلة أدناه النتائج التمثيلية بعد استخدام طريقة تلقيح غمد أوراق الذرة. توضح هذه الأمثلة السهولة والسرعة والدقة التي يمكن من خلالها تحقيق الملاحظة والمقارنة بين تفاعلات الذرة والفطريات في الوقت الفعلي باستخدام هذا الفحص الأمثل. يسمح تصوير الخلايا الحية أيضا باستخراج المعلومات الك?.......

Discussion

تم تعديل طريقة تلقيح غمد الأوراق المحسنة الموصوفة هنا من بروتوكول أصلي تم تطويره وتم تطبيقه على أغلفة أوراق الأرز^6،8،36. يسمح بملاحظات مباشرة ومفصلة لنمو الفطريات وتطورها في الخلايا النباتية الحية إما بالمجهر واسع المجال أو متحد البؤر. ال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiocam monochrome microscope camera	ZEISS	426560-9010-000	Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope	ZEISS	N/A	Allows live viewing and image/video capture of biological samples
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL	Thermo Fisher Scientific	75002431	Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid	Fisher Scientific	08-757-105	Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper	Fisher Scientific	09-920-115	Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope	Olympus	N/A	For visualization of fungal transformants'
Germination paper	Anchor Paper Co.	SD7615L	76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes	VWR International	75845-542	Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool	Ohio Valley Specialty Chemical	3350	For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass	VWR International	15170-172	0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips	Fisher Scientific	12-553-457	Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds	West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada	CN361	Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	1.5 mL capacity
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-123	Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)	VWR International	255210	Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish	Revlon	43671	Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate	USA Sientific	1402-9500	100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-5390	Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective	Olympus	1-UB933	Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)	VWR International	90000-758	Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX	Premium Horticulture Supply Co.	N/A	Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers	Greenhouse Megastore	CN-SS-SC-10B	1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray	Greenhouse Megastore	CN-SS-SCTR98	24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade	Thermo Fisher Scientific	17-989-145	AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure	Target	002-02-0405	Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity