Bainhas de milho destacadas para imagens de células vivas da infecção por patógenos fúngicos foliares de milho

Resumo

Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.

Resumo

Otimizamos um protocolo para inocular bainhas foliares de milho com fungos hemibiotróficos e necrotróficos foliares patogênicos. O método é modificado a partir de um originalmente aplicado em bainhas de folhas de arroz e permite a observação microscópica direta do crescimento e desenvolvimento de fungos em células vivas de plantas. Bainhas foliares coletadas de plântulas de milho com dois colares de folhas completamente emergidos são inoculadas com gotas de 20 μL de suspensões de esporos fúngicos de 5 x 10⁵ esporos/mL e incubadas em câmaras de umidade a 23 °C sob luz fluorescente contínua. Após 24-72 h, o excesso de tecido é removido com uma lâmina de barbear para deixar uma única camada de células epidérmicas, uma amostra opticamente clara que pode ser fotografada diretamente sem a necessidade de fixação química ou clareamento. Células de plantas e fungos permanecem vivas durante todo o experimento e as interações podem ser visualizadas em tempo real. As bainhas podem ser coradas ou submetidas à plasmólise para estudar a citologia do desenvolvimento e a viabilidade das células do hospedeiro e do patógeno durante a infecção e colonização. Cepas fúngicas transformadas para expressar proteínas fluorescentes podem ser inoculadas ou co-inoculadas nas bainhas para maior resolução e para facilitar a avaliação de interações competitivas ou sinérgicas. Cepas fúngicas expressando proteínas de fusão fluorescente podem ser usadas para rastrear e quantificar a produção e o direcionamento dessas proteínas individuais em planta. Tecidos da bainha inoculados podem ser extraídos para caracterizar ácidos nucléicos, proteínas ou metabólitos. O uso destes ensaios de bainha tem avançado muito os estudos detalhados dos mecanismos de patogenicidade fúngica em milho e também de efetores de proteínas fúngicas e metabólitos secundários que contribuem para a patogenicidade.

Introdução

Análises espaciais e temporais em nível celular são críticas para o entendimento da fisiologia e citologia das interações fúngico-planta. Tecidos foliares quimicamente^fixados1,2,3 ou clareados4^, bem como membranas artificiais5, têm sido utilizados no passado para investigar a citologia do desenvolvimento de patógenos foliares e interações planta-fungos. No entanto, a investigação de eventos infecciosos em tecidos vivos do hospedeiro em tempo real, sem fixação ou clareamento, é um desafio devido a questões técnicas relacionadas à....

Protocolo

Observação : o fluxo de trabalho para o método é mostrado na Figura 1.

Figura 1: Etapas do protocolo de inoculação otimizado utilizando bainhas de folhas de milho destacadas. O preparo da suspensão de esporos, a inoculação da bainha foliar e o preparo da amostra para microscopia de células vivas são destacados nas caixas verde (A), roxa (B) e laranja (C

Discussão

O método otimizado de inoculação de bainha foliar aqui descrito é modificado de um protocolo original que foi desenvolvido e aplicado em bainhas foliares de arroz ^6,8,36. Permite observações diretas e detalhadas do crescimento e desenvolvimento de fungos em células vegetais vivas com microscopia de campo amplo ou confocal. O protocolo é adequado para caracterização, comparação e quantificação de uma variedade de fe.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiocam monochrome microscope camera	ZEISS	426560-9010-000	Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope	ZEISS	N/A	Allows live viewing and image/video capture of biological samples
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL	Thermo Fisher Scientific	75002431	Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid	Fisher Scientific	08-757-105	Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper	Fisher Scientific	09-920-115	Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope	Olympus	N/A	For visualization of fungal transformants'
Germination paper	Anchor Paper Co.	SD7615L	76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes	VWR International	75845-542	Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool	Ohio Valley Specialty Chemical	3350	For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass	VWR International	15170-172	0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips	Fisher Scientific	12-553-457	Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds	West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada	CN361	Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	1.5 mL capacity
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-123	Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)	VWR International	255210	Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish	Revlon	43671	Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate	USA Sientific	1402-9500	100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-5390	Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective	Olympus	1-UB933	Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)	VWR International	90000-758	Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX	Premium Horticulture Supply Co.	N/A	Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers	Greenhouse Megastore	CN-SS-SC-10B	1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray	Greenhouse Megastore	CN-SS-SCTR98	24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade	Thermo Fisher Scientific	17-989-145	AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure	Target	002-02-0405	Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity