Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

Özet

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Özet

Mısır yaprağı kılıflarını hemibiotrofik ve nekrotrofik yaprak patojenik mantarlarla aşılamak için bir protokolü optimize ettik. Yöntem, orijinal olarak pirinç yaprağı kılıflarına uygulanandan modifiye edilmiştir ve canlı bitki hücrelerinde mantar büyümesi ve gelişiminin doğrudan mikroskobik gözlemine izin verir. İki adet tam yaprak boğazı ile mısır fidelerinden toplanan yaprak kılıfları, 20 μL damla 5 x 10⁵ spor/mL mantar sporu süspansiyonu ile aşılanır ve sürekli floresan ışık altında 23 °C'de nem odalarında inkübe edilir. 24-72 saat sonra, kimyasal fiksasyon veya temizleme gerektirmeden doğrudan görüntülenebilen optik olarak berrak bir numune olan tek bir epidermal hücre tabakası bırakmak için fazla doku bir tıraş bıçağıyla çıkarılır. Bitki ve mantar hücreleri deney süresince canlı kalır ve etkileşimler gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir. Kılıflar, enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında konakçı ve patojen hücrelerin gelişimsel sitolojisini ve canlılığını incelemek için boyanabilir veya plazmolize tabi tutulabilir. Floresan proteinleri eksprese etmek için dönüştürülen mantar suşları, daha fazla çözünürlük için ve rekabetçi veya sinerjik etkileşimlerin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için kılıflar üzerine aşılanabilir veya birlikte aşılanabilir. Floresan füzyon proteinlerini eksprese eden mantar suşları, plantadaki bu bireysel proteinlerin üretimini ve hedeflenmesini izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Aşılanmış kılıf dokuları, nükleik asitleri, proteinleri veya metabolitleri karakterize etmek için ekstrakte edilebilir. Bu kılıf tahlillerinin kullanımı, mısırda mantar patojenitesi mekanizmalarının ve ayrıca patojeniteye katkıda bulunan mantar protein efektörlerinin ve ikincil metabolitlerin ayrıntılı çalışmalarını büyük ölçüde ilerletmiştir.

Giriş

Hücresel düzeyde mekansal ve zamansal analizler, mantar-bitki etkileşimlerinin fizyolojisini ve sitolojisini anlamak için kritik öneme sahiptir. Kimyasal olarak sabitlenmiş ^1,2,3 veya temizlenmiş ve boyanmış⁴ yaprak dokuları ve yapay zarlar^5, geçmişte yaprak patojen gelişiminin sitolojisini ve bitki-mantar etkileşimlerini araştırmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, canlı konakçı dokulardaki enfeksiyon olaylarının fiksasyon veya temizleme olmadan gerçek zamanlı olarak araştırılması, görüntüleme için optik olarak şeffaf örne....

Protokol

NOT: Yöntemin iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1: Ayrılmış mısır yaprağı kılıfları kullanılarak optimize edilmiş aşılama protokolündeki adımlar. Spor süspansiyon hazırlama, yaprak kılıfı aşılama ve canlı hücre mikroskobu için numune hazırlama sırasıyla yeşil (A), mor (B) ve turuncu (C) kutularda vurgulanmıştır. BioRender.com ile oluşturuldu. ....

Tartışmalar

Burada açıklanan optimize edilmiş yaprak kılıfı aşılama yöntemi, pirinç yaprağı kılıfları^6,8,36 için geliştirilmiş ve uygulanmış olan orijinal bir protokolden değiştirilmiştir. Geniş alan veya konfokal mikroskopi ile canlı bitki hücrelerinde mantar büyümesi ve gelişiminin doğrudan, ayrıntılı gözlemlerine izin verir. Protokol, mısır kolonizasyonu sırasında, uyumlu ve uyumsuz etkileşimler sı.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiocam monochrome microscope camera	ZEISS	426560-9010-000	Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope	ZEISS	N/A	Allows live viewing and image/video capture of biological samples
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL	Thermo Fisher Scientific	75002431	Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid	Fisher Scientific	08-757-105	Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper	Fisher Scientific	09-920-115	Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope	Olympus	N/A	For visualization of fungal transformants'
Germination paper	Anchor Paper Co.	SD7615L	76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes	VWR International	75845-542	Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool	Ohio Valley Specialty Chemical	3350	For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass	VWR International	15170-172	0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips	Fisher Scientific	12-553-457	Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds	West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada	CN361	Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	1.5 mL capacity
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-123	Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)	VWR International	255210	Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish	Revlon	43671	Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate	USA Sientific	1402-9500	100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-5390	Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective	Olympus	1-UB933	Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)	VWR International	90000-758	Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX	Premium Horticulture Supply Co.	N/A	Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers	Greenhouse Megastore	CN-SS-SC-10B	1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray	Greenhouse Megastore	CN-SS-SCTR98	24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade	Thermo Fisher Scientific	17-989-145	AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure	Target	002-02-0405	Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity