АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной рукописи подробно описан оптимизированный протокол инокуляции, в котором для воспроизводимых цитологических, физиологических и молекулярных исследований взаимодействия кукурузы с грибковыми патогенами растений используются отдельные оболочки листьев кукурузы. Влагалища листьев облегчают наблюдение в режиме реального времени за клеточными взаимодействиями между живым растением и грибом в нефиксированных тканях.

Аннотация

Оптимизирован протокол инокуляции влагалищ листьев кукурузы гемибиотрофными и некротрофными листовыми патогенными грибами. Этот метод является модификацией по сравнению с методом, первоначально примененным к влагалищу рисовых листьев, и позволяет проводить прямые микроскопические наблюдения за ростом и развитием грибов в живых клетках растений. Влагалища листьев, собранные с проростков кукурузы с двумя полностью раскрывшимися листовыми шейками, инокулируют 20 мкл капель суспензий спор грибов 5 x 105 спор /мл и инкубируют во влажных камерах при температуре 23 °C при непрерывном флуоресцентном свете. Через 24-72 ч лишняя ткань удаляется лезвием бритвы, оставляя один слой клеток эпидермиса, оптически чистый образец, который можно визуализировать непосредственно без необходимости химической фиксации или очистки. Клетки растений и грибов остаются живыми в течение всего эксперимента, а взаимодействия могут быть визуализированы в режиме реального времени. Оболочки могут быть окрашены или подвергнуты плазмолизу для изучения цитологии развития и жизнеспособности клеток хозяина и патогена во время инфекции и колонизации. Штаммы грибов, трансформируемые для экспрессии флуоресцентных белков, могут быть инокулированы или коинокулированы на оболочки для повышения разрешения и облегчения оценки конкурентных или синергетических взаимодействий. Штаммы грибов, экспрессирующие флуоресцентные белки слияния, могут быть использованы для отслеживания и количественной оценки производства и нацеливания этих отдельных белков в planta. Инокулированные ткани оболочки могут быть извлечены для определения характеристик нуклеиновых кислот, белков или метаболитов. Использование этих оболочечных анализов значительно продвинуло вперед детальные исследования механизмов патогенности грибов в кукурузе, а также эффекторов грибных белков и вторичных метаболитов, способствующих патогенности.

Введение

Пространственный и временной анализ на клеточном уровне имеет решающее значение для понимания физиологии и цитологии взаимодействий грибов и растений. Листовые ткани, которые были химически закреплены 1,2,3 или очищены и окрашены4, а также искусственные мембраны5 использовались в прошлом для изучения цитологии развития листовых патогенов и взаимодействия растений с грибами. Тем не менее, исследование инфекционных событий в тканях живого хозяина в режиме реального времени без фиксации или очистки является сложной задачей из-за технических проблем, связанных с подготовкой оптически прозрачных образцов для визуализации.

В конце 1940-х годов был разработан протокол инокуляции оболочек листьев для ярко-полевого микроскопического исследования резистентности живых клеток эпидермиса риса к рисовому бластному грибу Magnaporthe oryza6. В последнее время детальные молекулярные, физиологические и цитологические наблюдения за колонизацией хозяина видами Colletotrichum и Magnaporthe были значительно облегчены благодаря сочетанию модифицированных версий этого метода с грибными трансформантами, экспрессирующими флуоресцентные белки, и высокоэффективными протоколами визуализации живых клеток, включая эпифлуоресценцию и конфокальную микроскопию7,8,9,10.11,12,13.

В данной работе подробно описан оптимизированный протокол инокуляции с использованием отслоившихся влагалищ листьев кукурузы для наблюдения за процессами заражения гемибиотрофными и некротрофными листовыми грибковыми патогенами. Мы специально использовали его для изучения Colletotrichum graminicola (C. graminicola), возбудителя антракноза листьев и стеблевой гнили, и Stenocarpella maydis, которая вызывает фитофтороз листьев Diplodia и стеблевую гниль. Однако метод должен быть применим и к другим гемибиотрофным и некротрофным листовым грибковым патогенам. Цитологические и физиологические реакции во время инфекций и колонизации в этих иссеченных листовых влагалях аналогичны таковым в целых листовых пластинках12,14,15. Кроме того, гемибиотрофная колонизация клеток эпидермиса оболочки C. graminicola сходна с колонизацией клеток сердцевины стебля16,17. Отслоенные влагалища демонстрируют большую синхронность и экспериментальную воспроизводимость проникновения и колонизации грибов, чем листовые пластинки или ткани сердцевины стебля14,16,17,18. Для этого протокола можно использовать большинство сортов кукурузы. Тем не менее, инбредные или гибриды с избыточным количеством фиолетовых пигментов в влагалях менее подходят, поскольку пигменты мешают визуализации. Сладкая кукуруза «Золотой юбилей» была особенно полезна для наших исследований, потому что необработанные семена коммерчески доступны, растения очень восприимчивы ко многим листовым заболеваниям и хорошо растут в теплице. Первые эпидемии антракнозной стеблевой гнили в США привели к полной потере урожая сахарной кукурузы в Индиане в 1970-х годах19,20. Этот метод инокуляции влагалища листа может быть применен для непосредственного наблюдения и количественной оценки роста и развития грибков в живых и локально убитых растительных клетках, для демонстрации реакций резистентности в совместимых/несовместимых ответах на грибковую инфекцию, а также для тестирования взаимодействия между штаммами грибов на одной и той же оболочке в режиме реального времени.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс для метода показан на рисунке 1.

figure-protocol-187
Рисунок 1: Этапы оптимизированного протокола инокуляции с использованием отсоединенных влагалищ листьев кукурузы. Приготовление споровой суспензии, инокуляция влагалища листа и подготовка образца для микроскопии живых клеток выделены зеленым (A), фиолетовым (B) и оранжевым (C) прямоугольниками соответственно. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

1. Растительный и грибковый материал

  1. Рост растений
    1. Выращивайте рассаду кукурузы (см. Таблицу материалов) в теплице (14 часов света/27 °C и 10 часов темноты/22 °C) в контейнерах SC10 (см. Таблицу материалов). Используйте питательную среду, состоящую из трех частей коммерческой горшечной почвы (см. Таблицу материалов) и двух частей стерилизованного паром верхнего слоя почвы.
    2. Поливайте рассаду на 2 мин с помощью системы верхнего орошения один раз в день, утром.
    3. Заготавливают саженцы на стадии V2, обрезая их на уровне почвы. Стадия роста V2 достигается, когда сеянцы достигают 5-10 см в высоту и имеют два видимых воротничковых листа21.
    4. Оберните растения влажным бумажным полотенцем и поместите в полиэтиленовый пакет для транспортировки в лабораторию для дальнейшей обработки.
  2. Грибковые культуры
    1. Реактивируют хранящиеся культуры грибкового кремнезема в асептических условиях22, посыпая примерно 50 гранулами зараженного кремнезема на соответствующую агаровую среду. Во избежание морфологических изменений и потери патогенности штаммы субкультуры после реактивации проводят не более 3 раз. Картофельный декстрозный агар (PDA; см. Таблицу материалов) обычно используется для культивирования C. graminicola, в то время как овсяный агар (OA; см. Таблицу материалов) используется для S. maydis.
    2. Для приготовления КПК для культивирования грибковых подвоев суспендируют 19,5 г промышленно приготовленного обезвоженного КПК в 500 мл деионизированной (ДИ) воды. Для получения ОА 36 г промышленно приготовленного обезвоженного ОА кипятят в деионизированной воде в течение 15-30 мин, процеживают через три слоя марли и доводят фильтрат до 500 мл децентрализованной водой. Автоклавная среда для стерилизации.
    3. При работе со штаммами-трансформантами дополняйте расплавленную охлажденную среду подходящим антибиотиком (например, гигромицином В, генетиком). Конечные концентрации гигромицина или генетицина в 500 мл среды составляют 250 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно.
    4. Инкубируют культуры в оптимальных условиях до тех пор, пока не разовьется спорулирующий мицелий. Colletotrichum graminicola и S. maydis хорошо растут при температуре 23 °C при постоянном флуоресцентном освещении и уровне влажности окружающей среды. Спороношение происходит через 7 дней после инокуляции (dai) для S. maydis или 14 dai для C. graminicola.

2. Прививки влагалища листа

  1. Монтаж фильтрующего блока из стекловаты
    1. С помощью сверхпрочных ножниц или ножниц отрежьте колпачок и примерно 0,5 мм от конического дна пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл (см. Таблицу материалов).
    2. Поместите кусок стекловаты (примерно 0,5 см x 0,5 см; см. Таблицу материалов) внутрь отрезанной трубки, чтобы закрыть центральное отверстие, как показано на рисунке 2.
    3. При резке стекловаты надевайте перчатки, так как боросиликатное стекло может вызвать раздражение.
  2. Подготовка опорных стоек оболочки листа
    1. Разрежьте 96-луночную ПЦР-пластину без юбки (см. таблицу материалов) на шесть двухколонных (8 x 2 лунки) опорных стоек, как показано на рисунке 3A.
    2. Переверните стойки с двумя колоннами так, чтобы конические дно колодцев были обращены вверх, а плоские верхушки — вниз (Рисунок 3B).
    3. Поместите каждую опору в стеклянную чашку Петри, содержащую увлажненную фильтровальную бумагу, и накройте ее крышкой (см. Таблицу материалов). Этот блок функционирует как небольшая камера влажности для ножен.
  3. Подготовка посевного материала
    1. Для каждого штамма гриба поместите один собранный фильтрующий блок из стекловаты в неповрежденную стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, как показано на рисунке 2. Последний функционирует как сборная трубка.
    2. Промаркируйте трубки.
    3. Собирают конидии со спорулирующих культур, предварительно заливая каждую тарелку 3-4 мл стерильной деионизированной воды. В некоторых случаях может потребоваться больше воды для образования слоя жидкости на поверхности колонии. Смачивающие агенты в этой системе не требуются.
    4. Удалите споры из агара с помощью стерильного пестика с коническим кончиком (см. Таблицу материалов), чтобы равномерно соскрести по всей пластине.
    5. Нанесите 1 мл споровой суспензии на фильтр из стекловаты асептически и дайте спорам протечь в сборную трубку под действием силы тяжести.
    6. Центрифугируют пробирки для сбора отфильтрованных споровых суспензий при 3 500 x g в течение 5 мин. Споры должны быть гранулированы на дне пробирки микроцентрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование спор C. graminicola на более высоких скоростях, чем рекомендуется здесь, приводит к значительной потере жизнеспособности.
    7. Перелейте жидкость в автоклавируемый контейнер, добавьте 1 мл стерильной деионизированной воды и осторожно перемешайте, чтобы ресуспендировать гранулированные споры. Центрифугу, как показано на шаге 2.3.6.
    8. Промойте споры 3 раза, чтобы удалить любой конидиальный матрикс, который может содержать аутоингибиторы, которые могут снизить прорастание или проникновение.
    9. После третьей промывки добавьте 300-500 мкл стерильной деионизированной воды, чтобы повторно суспендировать споры для количественного определения.
    10. Используйте гемоцитометр под составным микроскопом при 100-кратном увеличении для определения концентрации спор. Окрашивание спор перед подсчетом не требуется.
    11. Приготовьте суспензию 5 x 10 по5 спор/мл со стерильной деионизированной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензию спор C. graminicola можно хранить при комнатной температуре не более 4 ч до быстрой потери жизнеспособности. Охлаждение конидий не повышает жизнеспособность.
  4. Прививки влагалища
    1. Ознакомьтесь с соответствующими методами и процедурами биобезопасности перед инокуляцией растений штаммами грибов.
    2. Удалите влагалище с первого настоящего листа проростков V2, проведя ногтем большого пальца по перекрывающемуся краю влагалища, и аккуратно отсоедините его от побега. Ослабьте влагалище с обеих сторон побега, прежде чем пытаться его снять.
    3. Восстановленные влагалища листьев разрезать на отрезки по 3-5 см. Дезинфицировать поверхности влагалища перед прививкой не нужно.
    4. Очень осторожно разверните каждый сегмент, чтобы обнажить внутренний (адаксиальный) эпидермальный слой.
    5. Подготавливая влагалища к инокуляции, держите оставшиеся иссеченные влагалища обернутыми влажным бумажным полотенцем, чтобы избежать высыхания.
    6. Поместите 20 мкл суспензии спор гриба на внутреннюю поверхность в центре оболочки, непосредственно над средней жилкой, как показано на рисунке 4.
    7. Поместите инокулированные влагалища листьев горизонтально, поместив среднюю жилку внизу, в опору внутри стеклянной пластины Петри, содержащей увлажненную фильтровальную бумагу, как показано на рисунке 5.
    8. Каждая стойка вмещает до семи ножен. Инокулируйте не менее пяти оболочек для каждого штамма, чтобы компенсировать потерю репликатов, которая может произойти во время подготовки образца или инкубации.
    9. Поместите небольшие камеры влажности в прозрачный ящик для хранения, застеленный увлажненной бумагой для проращивания (см. Таблицу материалов).
    10. Накройте коробку крышкой. Инкубируйте ящик при температуре 23 °C при непрерывном освещении в течение предполагаемого периода времени, который зависит от грибка и от стадий развития грибка, которые будут наблюдаться. Краткая информация о динамике времени для влагалищ кукурузы, инокулированных C. graminicola, представлена в таблице 1.
    11. Каждый день проверяйте наличие признаков/симптомов заболевания на влагалищах и поддерживайте влажностью как всхожесть, так и фильтровальную бумагу. Влагалища листьев могут сохраняться до 6 дней без явной гибели или деградации растительных клеток при отсутствии инокуляции.

figure-protocol-9574
Рисунок 2: Подготовка стекловатного фильтрующего блока. (A) Шарик из стекловаты размером 0,5 см x 0,5 см помещается в микроцентрифужную пробирку 1 со снятым коническим дном. (В-В) Затем фильтрующая трубка помещается в микроцентрифужную трубку 2 для создания собранного фильтрующего блока для приготовления споровой суспензии. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-10322
Рисунок 3: Способ разрезания 96-луночного ПЦР-планшета без юбки. (A) ПЦР-пластина, разрезанная на шесть опорных стоек, 8 x 2 лунки. Пример одинарной опоры оболочки изображен на рисунке (В). Влагалища листьев укладываются горизонтально на опору. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-10989
Рисунок 4: Способ инокуляции влагалища. Одна капля посевного материала наносится непосредственно на адаксиальную поверхность участка оболочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-11504
Рисунок 5: Метод инкубации влагалища. Влагалища инокулированных листьев помещают горизонтально в опорную стойку внутри стеклянной пластины Петри, содержащей смоченную фильтровальную бумагу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Микроскопия живых клеток

  1. Подготовка образцов для микроскопии
    1. Аккуратно промойте кусочки оболочки стерильной деионизированной водой, чтобы удалить неприлипшие споры или поверхностный грибковый рост.
    2. Поместите оболочку на чистое предметное стекло микроскопа (см. Таблицу материалов) так, чтобы адаксиальная (внутренняя) поверхность оболочки была обращена вниз, а абаксиальная (внешняя) поверхность — сверху.
    3. Используйте новое лезвие бритвы с одной лезвием (см. Таблицу материалов), чтобы отрезать примерно 1 см от концов ножен и удалить большую часть ткани пластинки по обе стороны от средней жилки.
    4. Держите лезвие бритвы под углом 90° относительно ножен, чтобы сбрить ткань с абаксиальной средней жилки и обнажить эпидермальный слой на адаксиальной поверхности над привитым пятном. Старайтесь выдерживать равномерную толщину. После того, как влагалища листьев сбриты, дальнейшая обрезка не рекомендуется, так как это может повредить образец.
    5. Следите за тем, чтобы размер сбритых прядей не превышал 1 см х 1 см. Избегайте надавливания на центр ножен во время этого процесса. При работе с оболочками, инокулированными различными споровыми суспензиями, дезинфицируйте перчатки и меняйте лезвие бритвы между образцами.
    6. Держите наготове чистое стеклянное предметное стекло микроскопа. Поднимите секцию ножен с одного края и осторожно перенесите ее на новый салазки. Инокулированная (адаксиальная) поверхность оболочки должна быть самой верхней, ближайшей к линзе объектива. Монтируйте секции аккуратно, чтобы не повредить грибковые конструкции.
    7. Нанесите 60 мкл стерильной деионизированной воды на срез и добавьте стеклянный покровный лист размером 24 мм x 60 мм (см. Таблицу материалов). Делайте это медленно, чтобы избежать пузырьков воздуха.
    8. Когда все будет готово к микроскопии, запечатайте покровное стекло прозрачным лаком для ногтей (см. Таблицу материалов), поместив небольшую каплю на каждый край, а затем соединив капли вместе кистью для лака для ногтей, чтобы получить бесшовное уплотнение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оболочки может быть использован с цитологическими красителями, например, 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), нейтральным красным или трипановым синим, или для наблюдения за клеточным плазмолизом для оценки жизнеспособности растительных клеток. Для окрашивания оболочки или анализа клеточного плазмолиза не запечатывайте покровное стекло.
    9. Для плазмолизного анализа добавляют гипертонический раствор (0,75 М сахарозы или 1 М натрия хлорида) к одному краю покровного стекла и используют сложенную безворсовую папиросную бумагу, чтобы провести раствор по образцу к другому краю покровного стекла. Для окрашивания используйте аналогичный способ нанесения раствора для морилки.
  2. Широкопольная микроскопия
    1. После того, как влагалища листьев будут установлены на предметные стекла микроскопа, осмотрите их на предмет грибковой колонизации с помощью широкопольного светового микроскопа с 400-кратным увеличением.
    2. Для детального изучения грибковых структур используйте объектив для погружения в воду, а не масло для лучшего качества изображения образцов. Сферическая аберрация, вызванная несоответствием показателя преломления, может привести к ухудшению качества изображения. Водные объективы доступны как для широкопольных, так и для конфокальных микроскопов.
    3. Чтобы определить относительную степень колонизации на оболочке, подсчитайте количество клеток кукурузы, захваченных из каждого места проникновения гриба, используя широкопольный световой микроскоп при 100-кратном увеличении. Эта количественная оценка является подходящим этапом скрининга перед любым статистическим анализом, сравнивающим штаммы, методы лечения и/или стадии развития.
  3. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
    1. Для наблюдения флуоресцентных белков в тканях кукурузы при развитии трансгенных штаммов грибов необходимо настроить основные параметры получения изображения. Определите наилучшие настройки возбуждения/излучения на основе выбранного флуоресцентного маркера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив с 60-кратным увеличением количества воды является предпочтительным при анализе флуоресцентных слияний, построенных с секретируемыми белками. Современные конфокальные микроскопы имеют высоко скорректированные объективы для погружения в воду, чтобы избежать артефактов и аберраций формы.
    2. Если предполагается визуализация флуоресцентных белков живыми клетками, используйте нетрансформированные штаммы грибов в качестве контроля автофлуоресценции. Используйте следующие параметры получения изображения для регистрации динамики гриба-хозяина на инвертированном конфокальном микроскопе и для флуоресцентного белка mCherry. Установите мощность лазера до 5%, высокое напряжение (HV) 450-600 в зависимости от уровня экспрессии, усиление 1,375 X, смещение 3%, коэффициент оптического масштабирования 1 для анализа до пяти клеток кукурузы на секцию и коэффициент оптического увеличения 2-5 для отдельных гиф.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальные изображения Z-стека высокого разрешения предоставляют трехмерные данные и лучшее представление о взаимодействиях между хозяином и патогеном в режиме реального времени.
    3. Для количественной оценки интенсивности флуоресценции, соответствующей секретируемым слияниям белков, используйте программное обеспечение для анализа изображений от производителя конфокальных изображений или программу обработки изображений, такую как ImageJ, которую можно бесплатно загрузить в Интернете. Обратитесь к руководству для получения подробной информации о том, как соответствующим образом количественно оценить флуоресцентные сигналы.

Результаты

В приведенных ниже примерах описаны репрезентативные результаты при использовании метода инокуляции влагалища листьев кукурузы. Эти примеры демонстрируют легкость, скорость и точность, с которой наблюдение и сравнение взаимодействий кукурузы и грибов могут быть выполнены в режиме р...

Обсуждение

Оптимизированный метод инокуляции влагалища листа, описанный здесь, является модификацией оригинального протокола, который был разработан и применен для влагалищ листьев риса 6,8,36. Он позволяет проводить прямые, детальные наблюдения ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов и им нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят USDA-NIFA за финансовую поддержку (номера грантов 2018-67013-28489 и 2020-70410-32901). Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этой рукописи, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают точку зрения Министерства сельского хозяйства США. Мы благодарим студентку программы «Наука без границ» из Бразилии Майяру де Сильва за изображения, представленные на рисунке 6A и на рисунке 7D. Мы также выражаем признательность кафедре патологии растений Университета Кентукки за предоставление доступа к конфокальным микроскопам Olympus.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Axiocam monochrome microscope cameraZEISS426560-9010-000Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscopeZEISSN/AAllows live viewing and image/video capture of biological samples 
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mLThermo Fisher Scientific75002431Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lidFisher Scientific08-757-105Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper Fisher Scientific09-920-115Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscopeOlympusN/AFor visualization of fungal transformants' 
Germination paperAnchor Paper Co.SD7615L76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishesVWR International75845-542Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass;
complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool Ohio Valley Specialty Chemical 3350For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glassVWR International15170-1720.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslipsFisher Scientific12-553-457 Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seedsWest Coast Seeds Ltd., Delta, BC, CanadaCN361Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes USA Scientific  1415-25001.5 mL capacity
Microscope slides Fisher Scientific12-550-123 Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)VWR International255210Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polishRevlon43671Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plateUSA Sientific1402-9500100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubesUSA Scientific 1415-5390Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective Olympus1-UB933Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)VWR International90000-758Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BXPremium Horticulture Supply Co.N/APremium general-purpose growing medium formulated to provide
a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers Greenhouse Megastore CN-SS-SC-10B1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers trayGreenhouse Megastore CN-SS-SCTR9824 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor bladeThermo Fisher Scientific17-989-145AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closureTarget002-02-0405Clear view storage boxes for rmoist chamber;
outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity

Ссылки

  1. Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
  2. Hickey, E. L., Coffey, M. D. A fine-structural study of the pea downy mildew fungus Peronospora pisi in its host Pisum sativum. Canadian Journal of Botany. 55 (23), 2845-2858 (1977).
  3. Wharton, P. S., Julian, A. M., O'Connell, R. J. Ultrastructure of the infection of Sorghum bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology. 91 (2), 149-158 (2001).
  4. Latunde-Dada, A. O., et al. Infection process and identity of the hemibiotrophic anthracnose fungus (Colletotrichum destructivum O'Gara) from cowpea (Vigna unguiculata (L) Walp.). Mycological Research. 100 (9), 1133-1141 (1996).
  5. Bourett, T. M., Howard, R. J. In vitro development of penetration structures in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Canadian Journal of Botany. 68 (2), 329-342 (1990).
  6. Sakamoto, M. On the new method of sheath inoculation of rice plants with blast fungus, Pyricularia oryzae Cav., for the studying of the disease-resistant nature of the plant. Bulletin of the Institute for Agricultural Research, Tōhoku University. 1 (3), 120-129 (1949).
  7. Buiate, E. A., et al. A comparative genomic analysis of putative pathogenicity genes in the host-specific sibling species Colletotrichum graminicola and Colletotrichum sublineola. BMC genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Khang, C. H., et al. Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
  10. Mosquera, G., Giraldo, M. C., Khang, C. H., Coughlan, S., Valent, B. Interaction transcriptome analysis identifies Magnaporthe oryzae BAS1-4 as biotrophy-associated secreted proteins in rice blast disease. The Plant Cell. 21 (4), 1273-1290 (2009).
  11. Sakulkoo, W., et al. A single fungal MAP kinase controls plant cell-to-cell invasion by the rice blast fungus. Science. 359 (6382), 1399-1403 (2018).
  12. Torres, M. F., Cuadros, D. F., Vaillancourt, L. J. Evidence for a diffusible factor that induces susceptibility in the Colletotrichum-maize disease interaction. Molecular Plant Pathology. 15 (1), 80-93 (2014).
  13. Valent, B., Khang, C. H. Recent advances in rice blast effector research. Current Opinion in Plant Biology. 13 (4), 434-441 (2010).
  14. Mims, C. W., Vaillancourt, L. J. Ultrastructural characterization of infection and colonization of maize leaves by Colletotrichum graminicola, and by a C. graminicola pathogenicity mutant. Phytopathology. 92 (7), 803-812 (2002).
  15. Vargas, W. A., et al. Plant defense mechanisms are activated during biotrophic and necrotrophic development of Colletotricum graminicola in maize. Plant Physiology. 158 (3), 1342-1358 (2012).
  16. Venard, C., Vaillancourt, L. Colonization of fiber cells by Colletotrichum graminicola in wounded maize stalks. Phytopathology. 97 (4), 438-447 (2007).
  17. Venard, C., Vaillancourt, L. Penetration and colonization of unwounded maize tissues by the maize anthracnose pathogen Colletotrichum graminicola and the related nonpathogen C. sublineolum. Mycologia. 99 (3), 368-377 (2007).
  18. Berruyer, R., Poussier, S., Kankanala, P., Mosquera, G., Valent, B. Quantitative and qualitative influence of inoculation methods on in planta growth of rice blast fungus. Phytopathology. 96 (4), 346-355 (2006).
  19. Belisário, R., Robertson, A. E., Vaillancourt, L. J. Maize anthracnose stalk rot in the genomic era. Plant Disease. 106 (9), 2281-2298 (2022).
  20. Warren, H. L., Nicholson, R. L., Ullstrup, A. J., Sharvelle, E. G. Observations of Colletotrichum graminicola on sweet corn in Indiana. Plant Disease Reporter. 57, 143-144 (1973).
  21. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Special Report, Iowa State University. 48, (1986).
  22. Tuite, J. . Plant pathological methods: fungi and bacteria. , (1969).
  23. Wicklow, D. T., Rogers, K. D., Dowd, P. F., Gloer, J. B. Bioactive metabolites from Stenocarpella maydis, a stalk and ear rot pathogen of maize. Fungal Biology. 115 (2), 133-142 (2011).
  24. Daudi, A., O'Brien, J. A. Detection of hydrogen peroxide by DAB staining in Arabidopsis leaves. Bio-protocol. 2 (18), e263-e263 (2012).
  25. Benhamou, R. I., Jaber, Q. Z., Herzog, I. M., Roichman, Y., Fridman, M. Fluorescent tracking of the endoplasmic reticulum in live pathogenic fungal cells. ACS Chemical Biology. 13 (12), 3325-3332 (2018).
  26. Lorang, J. M., et al. fluorescent protein is lighting up fungal biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
  27. Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 182, e63846 (2022).
  28. Westermann, B., Neupert, W. Mitochondria-targeted green fluorescent proteins: convenient tools for the study of organelle biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 16 (15), 1421-1427 (2000).
  29. Lee, A. S. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress. Methods. 35 (4), 373-381 (2005).
  30. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), e12-e12 (2015).
  31. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: generation and applications. International Journal of Developmental Biology. 57 (6-7-8), 535-543 (2013).
  32. O'Connell, R. J., et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses. Nature Genetics. 44 (9), 1060-1065 (2012).
  33. Torres, M. F., et al. A Colletotrichum graminicola mutant deficient in the establishment of biotrophy reveals early transcriptional events in the maize anthracnose disease interaction. BMC Genomics. 17 (202), 1-24 (2016).
  34. Andrie, R. M., Martinez, J. P., Ciuffetti, L. M. Development of ToxA and ToxB promoter-driven fluorescent protein expression vectors for use in filamentous ascomycetes. Mycologia. 97 (5), 1152-1161 (2005).
  35. Gordon, C. L., et al. Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger. Microbiology. 146 (2), 415-426 (2000).
  36. Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
  37. Xavier, K. V., Pfeiffer, T., Parreira, D. F., Chopra, S., Vaillancourt, L. Aggressiveness of Colletotrichum sublineola strains from Sorghum bicolor and S. halepense to sweet sorghum variety Sugar Drip, and their impact on yield. Plant Disease. 101 (9), 1578-1587 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены