Отдельно взятые оболочки кукурузы для визуализации живых клеток инфекции, вызванной грибковыми листовыми патогенами кукурузы

Резюме

В данной рукописи подробно описан оптимизированный протокол инокуляции, в котором для воспроизводимых цитологических, физиологических и молекулярных исследований взаимодействия кукурузы с грибковыми патогенами растений используются отдельные оболочки листьев кукурузы. Влагалища листьев облегчают наблюдение в режиме реального времени за клеточными взаимодействиями между живым растением и грибом в нефиксированных тканях.

Аннотация

Оптимизирован протокол инокуляции влагалищ листьев кукурузы гемибиотрофными и некротрофными листовыми патогенными грибами. Этот метод является модификацией по сравнению с методом, первоначально примененным к влагалищу рисовых листьев, и позволяет проводить прямые микроскопические наблюдения за ростом и развитием грибов в живых клетках растений. Влагалища листьев, собранные с проростков кукурузы с двумя полностью раскрывшимися листовыми шейками, инокулируют 20 мкл капель суспензий спор грибов 5 x 10^{5 спор} /мл и инкубируют во влажных камерах при температуре 23 °C при непрерывном флуоресцентном свете. Через 24-72 ч лишняя ткань удаляется лезвием бритвы, оставляя один слой клеток эпидермиса, оптически чистый образец, который можно визуализировать непосредственно без необходимости химической фиксации или очистки. Клетки растений и грибов остаются живыми в течение всего эксперимента, а взаимодействия могут быть визуализированы в режиме реального времени. Оболочки могут быть окрашены или подвергнуты плазмолизу для изучения цитологии развития и жизнеспособности клеток хозяина и патогена во время инфекции и колонизации. Штаммы грибов, трансформируемые для экспрессии флуоресцентных белков, могут быть инокулированы или коинокулированы на оболочки для повышения разрешения и облегчения оценки конкурентных или синергетических взаимодействий. Штаммы грибов, экспрессирующие флуоресцентные белки слияния, могут быть использованы для отслеживания и количественной оценки производства и нацеливания этих отдельных белков в planta. Инокулированные ткани оболочки могут быть извлечены для определения характеристик нуклеиновых кислот, белков или метаболитов. Использование этих оболочечных анализов значительно продвинуло вперед детальные исследования механизмов патогенности грибов в кукурузе, а также эффекторов грибных белков и вторичных метаболитов, способствующих патогенности.

Введение

Пространственный и временной анализ на клеточном уровне имеет решающее значение для понимания физиологии и цитологии взаимодействий грибов и растений. Листовые ткани, которые были химически закреплены ^1,2,3 или очищены и окрашены^4, а также искусственные мембраны⁵ использовались в прошлом для изучения цитологии развития листовых патогенов и взаимодействия растений с грибами. Тем не менее, исследование инфекционных событий в тканях живого хозяина в режиме реального времени без фиксации или очистки является сложной задачей из-за те....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс для метода показан на рисунке 1.

Рисунок 1: Этапы оптимизированного протокола инокуляции с использованием отсоединенных влагалищ листьев кукурузы. Приготовление споровой суспензии, инокуляция влагалища листа и подготовка образца для микроскопии живых клеток выделены зеленым (A), фиолетовым (B) и оранжевым (C) прямоугольника....

Результаты

В приведенных ниже примерах описаны репрезентативные результаты при использовании метода инокуляции влагалища листьев кукурузы. Эти примеры демонстрируют легкость, скорость и точность, с которой наблюдение и сравнение взаимодействий кукурузы и грибов могут быть выполнены в режиме р.......

Обсуждение

Оптимизированный метод инокуляции влагалища листа, описанный здесь, является модификацией оригинального протокола, который был разработан и применен для влагалищ листьев риса ^6,8,36. Он позволяет проводить прямые, детальные наблюдения .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiocam monochrome microscope camera	ZEISS	426560-9010-000	Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope	ZEISS	N/A	Allows live viewing and image/video capture of biological samples
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL	Thermo Fisher Scientific	75002431	Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid	Fisher Scientific	08-757-105	Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper	Fisher Scientific	09-920-115	Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope	Olympus	N/A	For visualization of fungal transformants'
Germination paper	Anchor Paper Co.	SD7615L	76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes	VWR International	75845-542	Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool	Ohio Valley Specialty Chemical	3350	For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass	VWR International	15170-172	0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips	Fisher Scientific	12-553-457	Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds	West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada	CN361	Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	1.5 mL capacity
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-123	Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)	VWR International	255210	Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish	Revlon	43671	Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate	USA Sientific	1402-9500	100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-5390	Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective	Olympus	1-UB933	Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)	VWR International	90000-758	Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX	Premium Horticulture Supply Co.	N/A	Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers	Greenhouse Megastore	CN-SS-SC-10B	1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray	Greenhouse Megastore	CN-SS-SCTR98	24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade	Thermo Fisher Scientific	17-989-145	AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure	Target	002-02-0405	Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity