Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной рукописи подробно описан оптимизированный протокол инокуляции, в котором для воспроизводимых цитологических, физиологических и молекулярных исследований взаимодействия кукурузы с грибковыми патогенами растений используются отдельные оболочки листьев кукурузы. Влагалища листьев облегчают наблюдение в режиме реального времени за клеточными взаимодействиями между живым растением и грибом в нефиксированных тканях.

Аннотация

Оптимизирован протокол инокуляции влагалищ листьев кукурузы гемибиотрофными и некротрофными листовыми патогенными грибами. Этот метод является модификацией по сравнению с методом, первоначально примененным к влагалищу рисовых листьев, и позволяет проводить прямые микроскопические наблюдения за ростом и развитием грибов в живых клетках растений. Влагалища листьев, собранные с проростков кукурузы с двумя полностью раскрывшимися листовыми шейками, инокулируют 20 мкл капель суспензий спор грибов 5 x 105 спор /мл и инкубируют во влажных камерах при температуре 23 °C при непрерывном флуоресцентном свете. Через 24-72 ч лишняя ткань удаляется лезвием бритвы, оставляя один слой клеток эпидермиса, оптически чистый образец, который можно визуализировать непосредственно без необходимости химической фиксации или очистки. Клетки растений и грибов остаются живыми в течение всего эксперимента, а взаимодействия могут быть визуализированы в режиме реального времени. Оболочки могут быть окрашены или подвергнуты плазмолизу для изучения цитологии развития и жизнеспособности клеток хозяина и патогена во время инфекции и колонизации. Штаммы грибов, трансформируемые для экспрессии флуоресцентных белков, могут быть инокулированы или коинокулированы на оболочки для повышения разрешения и облегчения оценки конкурентных или синергетических взаимодействий. Штаммы грибов, экспрессирующие флуоресцентные белки слияния, могут быть использованы для отслеживания и количественной оценки производства и нацеливания этих отдельных белков в planta. Инокулированные ткани оболочки могут быть извлечены для определения характеристик нуклеиновых кислот, белков или метаболитов. Использование этих оболочечных анализов значительно продвинуло вперед детальные исследования механизмов патогенности грибов в кукурузе, а также эффекторов грибных белков и вторичных метаболитов, способствующих патогенности.

Введение

Пространственный и временной анализ на клеточном уровне имеет решающее значение для понимания физиологии и цитологии взаимодействий грибов и растений. Листовые ткани, которые были химически закреплены 1,2,3 или очищены и окрашены4, а также искусственные мембраны5 использовались в прошлом для изучения цитологии развития листовых патогенов и взаимодействия растений с грибами. Тем не менее, исследование инфекционных событий в тканях живого хозяина в режиме реального времени без фиксации или очистки является сложной задачей из-за те....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс для метода показан на рисунке 1.

figure-protocol-187
Рисунок 1: Этапы оптимизированного протокола инокуляции с использованием отсоединенных влагалищ листьев кукурузы. Приготовление споровой суспензии, инокуляция влагалища листа и подготовка образца для микроскопии живых клеток выделены зеленым (A), фиолетовым (B) и оранжевым (C) прямоугольника....

Результаты

В приведенных ниже примерах описаны репрезентативные результаты при использовании метода инокуляции влагалища листьев кукурузы. Эти примеры демонстрируют легкость, скорость и точность, с которой наблюдение и сравнение взаимодействий кукурузы и грибов могут быть выполнены в режиме р.......

Обсуждение

Оптимизированный метод инокуляции влагалища листа, описанный здесь, является модификацией оригинального протокола, который был разработан и применен для влагалищ листьев риса 6,8,36. Он позволяет проводить прямые, детальные наблюдения .......

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов и им нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят USDA-NIFA за финансовую поддержку (номера грантов 2018-67013-28489 и 2020-70410-32901). Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этой рукописи, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают точку зрения Министерства сельского хозяйства США. Мы благодарим студентку программы «Наука без границ» из Бразилии Майяру де Сильва за изображения, представленные на рисунке 6A и на рисунке 7D. Мы также выражаем признательность кафедре патологии растений Университета Кентукки за предоставление доступа к конфокальным микроскопам Olympus.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Axiocam monochrome microscope cameraZEISS426560-9010-000Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscopeZEISSN/AAllows live viewing and image/video capture of biological samples 
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mLThermo Fisher Scientific75002431Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lidFisher Scientific08-757-105Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper Fisher Scientific09-920-115Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscopeOlympusN/AFor visualization of fungal transformants' 
Germination paperAnchor Paper Co.SD7615L76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishesVWR International75845-542Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass;
complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool Ohio Valley Specialty Chemical 3350For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glassVWR International15170-1720.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslipsFisher Scientific12-553-457 Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seedsWest Coast Seeds Ltd., Delta, BC, CanadaCN361Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes USA Scientific  1415-25001.5 mL capacity
Microscope slides Fisher Scientific12-550-123 Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)VWR International255210Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polishRevlon43671Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plateUSA Sientific1402-9500100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubesUSA Scientific 1415-5390Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective Olympus1-UB933Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)VWR International90000-758Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BXPremium Horticulture Supply Co.N/APremium general-purpose growing medium formulated to provide
a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers Greenhouse Megastore CN-SS-SC-10B1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers trayGreenhouse Megastore CN-SS-SCTR9824 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor bladeThermo Fisher Scientific17-989-145AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closureTarget002-02-0405Clear view storage boxes for rmoist chamber;
outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity

Ссылки

  1. Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
  2. Hickey, E. L., Coffey, M. D.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены