Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В данной рукописи подробно описан оптимизированный протокол инокуляции, в котором для воспроизводимых цитологических, физиологических и молекулярных исследований взаимодействия кукурузы с грибковыми патогенами растений используются отдельные оболочки листьев кукурузы. Влагалища листьев облегчают наблюдение в режиме реального времени за клеточными взаимодействиями между живым растением и грибом в нефиксированных тканях.
Оптимизирован протокол инокуляции влагалищ листьев кукурузы гемибиотрофными и некротрофными листовыми патогенными грибами. Этот метод является модификацией по сравнению с методом, первоначально примененным к влагалищу рисовых листьев, и позволяет проводить прямые микроскопические наблюдения за ростом и развитием грибов в живых клетках растений. Влагалища листьев, собранные с проростков кукурузы с двумя полностью раскрывшимися листовыми шейками, инокулируют 20 мкл капель суспензий спор грибов 5 x 105 спор /мл и инкубируют во влажных камерах при температуре 23 °C при непрерывном флуоресцентном свете. Через 24-72 ч лишняя ткань удаляется лезвием бритвы, оставляя один слой клеток эпидермиса, оптически чистый образец, который можно визуализировать непосредственно без необходимости химической фиксации или очистки. Клетки растений и грибов остаются живыми в течение всего эксперимента, а взаимодействия могут быть визуализированы в режиме реального времени. Оболочки могут быть окрашены или подвергнуты плазмолизу для изучения цитологии развития и жизнеспособности клеток хозяина и патогена во время инфекции и колонизации. Штаммы грибов, трансформируемые для экспрессии флуоресцентных белков, могут быть инокулированы или коинокулированы на оболочки для повышения разрешения и облегчения оценки конкурентных или синергетических взаимодействий. Штаммы грибов, экспрессирующие флуоресцентные белки слияния, могут быть использованы для отслеживания и количественной оценки производства и нацеливания этих отдельных белков в planta. Инокулированные ткани оболочки могут быть извлечены для определения характеристик нуклеиновых кислот, белков или метаболитов. Использование этих оболочечных анализов значительно продвинуло вперед детальные исследования механизмов патогенности грибов в кукурузе, а также эффекторов грибных белков и вторичных метаболитов, способствующих патогенности.
Пространственный и временной анализ на клеточном уровне имеет решающее значение для понимания физиологии и цитологии взаимодействий грибов и растений. Листовые ткани, которые были химически закреплены 1,2,3 или очищены и окрашены4, а также искусственные мембраны5 использовались в прошлом для изучения цитологии развития листовых патогенов и взаимодействия растений с грибами. Тем не менее, исследование инфекционных событий в тканях живого хозяина в режиме реального времени без фиксации или очистки является сложной задачей из-за те....
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс для метода показан на рисунке 1.
Рисунок 1: Этапы оптимизированного протокола инокуляции с использованием отсоединенных влагалищ листьев кукурузы. Приготовление споровой суспензии, инокуляция влагалища листа и подготовка образца для микроскопии живых клеток выделены зеленым (A), фиолетовым (B) и оранжевым (C) прямоугольника....
В приведенных ниже примерах описаны репрезентативные результаты при использовании метода инокуляции влагалища листьев кукурузы. Эти примеры демонстрируют легкость, скорость и точность, с которой наблюдение и сравнение взаимодействий кукурузы и грибов могут быть выполнены в режиме р.......
Оптимизированный метод инокуляции влагалища листа, описанный здесь, является модификацией оригинального протокола, который был разработан и применен для влагалищ листьев риса 6,8,36. Он позволяет проводить прямые, детальные наблюдения .......
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов и им нечего раскрывать.
Авторы благодарят USDA-NIFA за финансовую поддержку (номера грантов 2018-67013-28489 и 2020-70410-32901). Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этой рукописи, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают точку зрения Министерства сельского хозяйства США. Мы благодарим студентку программы «Наука без границ» из Бразилии Майяру де Сильва за изображения, представленные на рисунке 6A и на рисунке 7D. Мы также выражаем признательность кафедре патологии растений Университета Кентукки за предоставление доступа к конфокальным микроскопам Olympus.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены