真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

要約

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。

要約

トウモロコシの葉鞘に半栄養性および壊死栄養性の葉面病原性真菌を接種するためのプロトコルを最適化しました。この方法は、もともとイネの葉鞘に適用されていた方法から変更され、生きた植物細胞の真菌の成長と発生を直接顕微鏡で観察することができます。トウモロコシの苗から採取した葉鞘に、2つの葉の襟が完全に出現し、20 μLの滴下(5 x 10⁵ 胞子/mLの真菌胞子懸濁液)を接種し、23°Cの湿度チャンバー内で連続蛍光灯下でインキュベートします。24〜72時間後、余分な組織をカミソリの刃で除去し、表皮細胞の単層、化学的固定や透明化を必要とせずに直接画像化できる光学的に透明なサンプルを残します。植物細胞と真菌細胞は実験期間中生き続け、相互作用をリアルタイムで視覚化できます。シースを染色または形質分解して、感染およびコロニー形成中の宿主細胞および病原体細胞の発生細胞診および生存率を研究することができます。蛍光タンパク質を発現するように形質転換された真菌株を鞘に接種または同時接種することで、分解能を高め、競合的または相乗的相互作用の評価を容易にすることができます。蛍光融合タンパク質を発現する真菌株を使用して、 プランタにおけるこれらの個々のタンパク質の産生および標的化を追跡および定量化することができます。接種した鞘組織を抽出して、核酸、タンパク質、または代謝物を特徴付けることができます。これらのシースアッセイの使用は、トウモロコシの真菌病原性のメカニズム、および病原性に寄与する真菌タンパク質エフェクターおよび二次代謝産物の詳細な研究を大幅に前進させました。

概要

細胞レベルでの空間的および時間的分析は、真菌と植物の相互作用の生理学と細胞学を理解するために重要です。過去には、化学的に固定された葉面組織^1,2,3または透明化して染色した⁴、および人工膜5が、葉面病原体の発生と植物と真菌の相互作用の細胞診を調べるために使用されてきました。しかし、固定や透明化を行わずに、生きた宿主組織の感染事象をリアルタイムで調べることは、イメージング用の光学的に透明なサンプルの調製に関連する技術的な問題があるため、困難です。

1940年代後半に、イネいもち病菌Magnaporthe oryza⁶に対する生きたイネ表皮細胞の耐性を明視野顕微鏡で調べるために、分離葉鞘接種プロトコルが開発されました。最近では、ColletotrichumおよびMagnaporthe種による宿主コロニー形成の詳細な分子学的、生理学的、および細胞学的観察は、この葉鞘法の修正バージョンと、蛍光タンパク質を発現する真菌形質転換体、および落射蛍光および共焦点顕微鏡検査を含む高性能生細胞イメージングプロトコルを組み合わせることによって非常に容易になりました7,8,9,10^、11^、12、13。

この論文では、半栄養性および壊死栄養性の葉状真菌病原体による感染過程を観察するために、剥離したトウモロコシ葉鞘を使用した最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。具体的には、炭疽病の葉枯れ病や茎腐病の原因菌であるColletotrichum graminicola(C. graminicola)や、ディプロディアの葉枯れ病や茎腐病の原因となるStenocarpella maydisの研究に使用しています。ただし、この方法は、他の半栄養性および壊死栄養性の葉面真菌病原体にも適用できるはずです。これらの切除された葉鞘における感染およびコロニー形成イベント中の細胞学的および生理学的応答は、葉身全体の反応と同様である12,14,15。さらに、C. graminicolaによる鞘表皮細胞の半栄養性コロニー形成は、茎髄細胞のコロニー形成に類似している^16,17。剥離した鞘は、葉身や茎の髄組織よりも、真菌の浸透とコロニー形成の同期性と実験的再現性が高いことを示しています14,16,17,18。ほとんどのトウモロコシ品種は、このプロトコルに使用できます。ただし、鞘に過剰な紫色の色素を持つ近交系またはハイブリッドは、色素がイメージングを妨げるため、あまり適していません。ゴールデンジュビリースイートコーンは、未処理の種子が市販されており、植物は多くの葉の病気に非常にかかりやすく、温室でよく育つため、私たちの研究に特に役立ちました。1970年代に米国で炭疽病の茎腐れ病が最初に流行した結果、インディアナ州ではスイートコーンの収穫が完全に失われました^19,20。この葉鞘接種法は、生きた植物細胞と局所的に殺された植物細胞の真菌の成長と発生を直接観察および定量化し、真菌感染に対する適合/非互換応答における耐性反応を実証し、同じ鞘上の真菌株間の相互作用をリアルタイムでテストするために適用できます。

プロトコル

注: このメソッドのワークフローを 図 1 に示します。

図1:剥離したトウモロコシの葉鞘を使用した最適化された接種プロトコルのステップ。 胞子懸濁液の調製、葉鞘の接種、生細胞顕微鏡用のサンプル調製は、それぞれ緑色(A)、紫色(B)、オレンジ色(C)のボックスで強調表示されています。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

1.植物および菌類材料

1. 植物の成長
   1. 温室(14時間明るい/ 27°Cおよび10時間暗い/ 22°C)でSC10容器(材料表を参照)でトウモロコシの苗木(材料表を参照)を栽培します。市販の鉢植え用土3部(材料表を参照)と蒸気滅菌した表土2部からなる成長培地を使用します。
   2. 毎日1回、朝に頭上灌漑システムで2分間苗に水をやります。
   3. V2段階で苗木を土壌レベルで刈り取り、収穫します。V2成長段階は、苗木の高さが5〜10 cmで、2つの目に見える襟付きの葉があるときに到達します²¹。
   4. 湿らせたペーパータオルで植物を包み、ビニール袋に入れて実験室に運び、さらに処理します。
2. 菌類培養
   1. 適切な寒天培地に約50粒の感染シリカを振りかけることにより、無菌条件下で保存された真菌シリカストック培養物を再活性化する²²。形態学的変化および病原性の喪失を避けるために、継代培養は再活性化後に3倍以下に菌株を添加する。ジャガイモデキストロース寒天培地(PDA;材料 表参照)は C.グラミニコラ の培養に日常的に使用され、オートミール寒天培地(OA; 材料表参照)は S.maydisに使用されます。
   2. 真菌ストックを培養するためのPDAを調製するには、市販の脱水PDA19.5gを500mLの脱イオン(DI)水に懸濁します。OAを作るには、市販の脱水OA36gを脱イオン水で15〜30分間煮沸し、3層のチーズクロスでろ過し、脱イオン水で500mLの濾液にします。滅菌するオートクレーブ媒体。
   3. 形質転換株を扱う場合は、溶融して冷却した培地に適切な抗生物質(ハイグロマイシンB、遺伝剤など)を添加します。培地500 mL中のハイグロマイシンまたはゲネチシンの最終濃度は、それぞれ250 μg/mLおよび100 μg/mLです。
   4. 胞子状の菌糸体が発達するまで、最適な条件下で培養物をインキュベートします。 Colletotrichum graminicola と S. maydis は、蛍光灯と周囲湿度レベルが連続する 23 °C でよく育ちます。胞子形成は、 S. maydis では接種後 7 日(dai)、 C. graminicola では 14 dai までに発生します。

2.葉鞘接種

1. グラスウールフィルターユニットアセンブリ
   1. 頑丈なハサミまたははさみを使用して、キャップと1.5 mL微量遠心チューブの円錐形の底から約0.5 mmを切り取ります( 材料表を参照)。
   2. グラスウール(約0.5 cm x 0.5 cm、 材料表を参照)をカットチューブの内側に置き、 図2に示すように中央の穴を覆います。
   3. ホウールガラスは刺激を引き起こす可能性があるため、グラスウールを切断するときは手袋を着用してください。
2. リーフシースサポートラックの準備
   1. 図3Aに示すように、スカートのない96ウェルPCRプレート(材料表を参照)を6つの2列(8 x 2ウェル)サポートラックに切断します。
   2. ウェルの円錐形の底が上を向き、平らな上部が下を向くように、2列ラックを裏返します(図3B)。
   3. 湿らせた濾紙を入れたガラスペトリプレートに各支持体を置き、蓋で覆います( 材料表を参照)。このユニットは、シース用の小さな湿度チャンバーとして機能します。
3. 接種剤の調製
   1. 各真菌株について、 図2に示すように、組み立てたグラスウールフィルターユニット1つを無傷の滅菌済み1.5 mL微量遠心チューブに入れます。後者は収集チューブとして機能します。
   2. チューブにラベルを付けます。
   3. 胞子培養物から分生子を採取するには、まず各プレートに3〜4 mLの滅菌脱イオン水を浸します。場合によっては、コロニー表面に液体の層を生成するために、より多くの水が必要になることがあります。このシステムでは湿潤剤は必要ありません。
   4. 滅菌された円錐形の先端の乳棒( 材料表を参照)を使用して寒天から胞子をほぐし、プレート全体を均等にこすります。
   5. 胞子懸濁液1mLをグラスウールフィルターユニットに無菌的に塗布し、胞子が重力によって収集チューブに流れるようにします。
   6. ろ過した胞子懸濁液を含むコレクションチューブを 3,500 x g で 5 分間遠心分離します。胞子は、微量遠心チューブの底にペレット化する必要があります。
      注:ここで推奨されている速度よりも速い速度で C.graminicola 胞子を遠心分離すると、生存率が大幅に失われます。
   7. 液体をオートクレーブ可能な容器に注ぎ、1 mLの滅菌脱イオン水を加え、穏やかに攪拌してペレット状の胞子を再懸濁します。ステップ2.3.6のように遠心分離します。
   8. 胞子を3回洗浄して、発芽や浸透を低下させる可能性のある自己阻害剤を含む可能性のある分生子マトリックスを取り除きます。
   9. 3回目の洗浄後、300〜500μLの滅菌DI水を加えて、胞子を再懸濁して定量します。
   10. 100倍の倍率の複合顕微鏡下で血球計算盤を使用して、胞子濃度を決定します。カウントする前に胞子染色は必要ありません。
   11. 5 x 10⁵ 胞子/mL懸濁液を滅菌脱イオン水で調製します。
       注: C.グラミニコラ 胞子懸濁液は、生存率が急速に失われる前に、室温で4時間以内に保つことができます。.分生子を冷蔵しても生存率は向上しません。
4. シース接種
   1. 植物に真菌株を接種する前に、関連するバイオセーフティの慣行と手順を確認してください。
   2. 鞘の重なり合う縁に沿って親指の爪を走らせて、V2苗の最初の本葉から鞘を取り除き、シュートからそっと緩めます。シュートを取り外す前に、シュートの両側からシースを緩めます。
   3. 回収した葉鞘を3〜5cmのセグメントに切ります。接種前にシースの表面消毒を行う必要はありません。
   4. 各セグメントを非常にゆっくりと広げて、内側(同軸)表皮層を露出させます。
   5. 接種用のシースを準備している間、乾燥を防ぐために、残りの切除シースを湿らせたペーパータオルで包んでおいてください。
   6. 真菌胞子懸濁液20 μLを、 図4に示すように、シース片の中央、中肋骨の真上の内面に置きます。
   7. 図5に示すように、接種した葉鞘を水平に置き、中肋骨を下にして、湿らせた濾紙を含むガラスペトリプレート内の支持体に入れます。
   8. 各ラックには最大7つのシースを収納できます。サンプル調製またはインキュベーション中に発生する可能性のある反復の損失を補うために、株ごとに少なくとも5つのシースを接種します。
   9. 小さな湿度チャンバーを、湿らせた発芽紙で裏打ちされた透明な収納ボックスに入れます( 材料表を参照)。
   10. 箱を蓋で覆います。ボックスを23°Cでインキュベートし、意図した時間経過の間、観察される真菌の発生段階に応じて連続的に照射します。 C. graminicola を接種したトウモロコシ鞘の経時変化の概要を 表1に示す。
   11. 鞘に病気の兆候や症状がないか毎日チェックし、発芽とろ紙の両方を湿らせておきます。葉鞘は、接種がない場合に明らかな植物細胞の死滅や分解なしに、最大6日間保持することができます。

図2:グラスウールフィルターユニットの準備。(A) 0.5cm×0.5cmのグラスウールボールを、円錐形の底を取り除いた微量遠心チューブ1の内側に入れます。 (B-C) 次いで、濾過管を微量遠心管2に入れて、胞子懸濁液調製用の組み立て済みフィルターユニットを生成する。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:スカートなしの96ウェルPCRプレートの切断方法。(A) PCRプレートを6つのサポートラック、8 x 2ウェルにカット。単一のシース支持体の例を (B )に示します。葉鞘は支持体に水平に置かれます。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:鞘の接種方法。 シース部のアキシャル面に直接塗布された接種液のシングルドロップ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:シースインキュベーション法。 接種した葉鞘を、湿らせた濾紙が入ったガラスペトリプレート内の支持ラックに水平に置いた。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

3. 生細胞顕微鏡

1. 顕微鏡用サンプル調製
   1. シース片を滅菌DI水でやさしくすすぎ、付着していない胞子や表面的な真菌の増殖を取り除きます。
   2. シースピースのアキシャル(内側)面を下向きにし、アキシャル(外側)面を一番上にして、シースを清潔なガラス顕微鏡スライド( 材料表を参照)に置きます。
   3. 新しい片刃のカミソリの刃( 材料表を参照)を使用して、シースの端を約1cm切り取り、中肋の両側の層組織のほとんどを取り除きます。
   4. かみそりの刃をシースに対して90°の角度で保持して、軸方向の中肋骨から組織を剃り、接種スポットの上の軸面に表皮層を露出させます。均一な厚さを維持するようにしてください。葉鞘を削った後は、サンプルを損傷する可能性があるため、それ以上のトリミングはお勧めしません。
   5. 剃った部分のサイズが1cm×1cm以下であることを確認してください。このプロセス中は、シースの中心を押さないでください。異なる胞子懸濁液を接種したシースを扱う場合は、手袋を消毒し、サンプル間でカミソリの刃を交換してください。
   6. 清潔なガラス顕微鏡スライドを用意しておいてください。シースセクションを片方の端から持ち上げ、慎重に新しいスライドに移します。シースの接種された(同軸)表面は、対物レンズに最も近い最上部にある必要があります。真菌構造への損傷を避けるために、セクションを静かに取り付けます。
   7. 切片に60 μLの滅菌脱イオン水を塗布し、24 mm x 60 mmのガラスカバーガラスを追加します( 材料表を参照)。気泡を避けるために、これをゆっくりと行ってください。
   8. 顕微鏡検査の準備ができたら、カバーガラスを透明なマニキュアで密封し( 材料表を参照)、各端に小さな滴を置き、滴をマニキュアブラシで接続してシームレスシールします。
      注:このシースプロトコルは、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、ニュートラルレッド、トリパンブルーなどの細胞学的染色剤、または植物細胞の生存率を評価するための細胞質分解の観察に使用できます。シース染色または細胞形質分解アッセイでは、カバーガラスを密封しないでください。
   9. プラズマ分解アッセイでは、高張溶液(0.75 Mスクロースまたは1 M塩化ナトリウム)をカバーガラスの一方の端に加え、折りたたんだ糸くずの出ないティッシュペーパーを使用して、サンプルを横切ってカバーガラスのもう一方の端まで溶液を引き寄せます。染色には、同様の方法で染色液を塗布します。
2. 広視野顕微鏡
   1. 葉鞘を顕微鏡スライドに取り付けたら、400倍の倍率の広視野光学顕微鏡を使用して真菌のコロニー形成を検査します。
   2. 真菌の構造を詳細に観察するには、サンプルの画質を向上させるために、油ではなく水浸対物レンズを使用します。屈折率のミスマッチによる球面収差は、画像劣化の原因となります。水対物レンズは、広視野光学顕微鏡と共焦点顕微鏡に使用できます。
   3. シースあたりのコロニー形成の相対量を決定するには、100倍の倍率の広視野光学顕微鏡を使用して、各真菌浸透部位から侵入したトウモロコシ細胞の数をカウントします。この定量化は、菌株、治療法、および/または発生段階を比較する統計分析の前に適切なスクリーニングステップです。
3. 共焦点レーザー走査型顕微鏡
   1. トランスジェニック真菌株の発生中にトウモロコシ組織中の蛍光タンパク質を観察するには、基本的な画像取得パラメーターを調整します。選択した蛍光マーカーに基づいて最適な励起/発光設定を特定します。
      注:分泌タンパク質で構築された蛍光融合体を分析する場合は、60倍の水対物レンズが望ましいです。最新の共焦点顕微鏡は、アーチファクトや形状収差を避けるために、高度に補正された水浸対物レンズを備えています。
   2. 蛍光タンパク質の生細胞イメージングを意図する場合は、自家蛍光のコントロールとして形質転換されていない真菌株を使用します。以下の画像取得パラメータを使用して、倒立共焦点顕微鏡およびmCherry蛍光タンパク質で真菌-宿主のダイナミクスをキャプチャします。レーザー出力を最大5%、発現レベルに応じて450〜600の高電圧(HV)、1.375 Xゲイン、3%オフセット、セクションあたり最大5つのトウモロコシ細胞の分析用の光学ズームファクター1、個々の菌糸の光学ズームファクターを2〜5に設定します。
      注:高解像度のZスタック共焦点画像は、3次元データを提供し、宿主と病原体の間のリアルタイムの相互作用をよりよく表示します。
   3. 分泌融合タンパク質に対応する蛍光強度の定量には、共焦点メーカーの画像解析ソフトウェアや、オンラインで無料でダウンロードできるImageJなどの画像処理プログラムを使用します。それに応じて蛍光シグナルを定量する方法の詳細については、マニュアルを参照してください。

結果

以下の例は、トウモロコシ葉鞘接種法を使用した後の代表的な結果を示しています。これらの例は、トウモロコシと真菌の相互作用の観察と比較を、この最適化されたアッセイでリアルタイムに行うことの容易さ、速度、精度を示しています。また、生細胞イメージングは定量的な情報の抽出を可能にし、分子学的、細胞学的、生理学的の比較研究に有用なツールを提供します。詳細につい?...

ディスカッション

ここで説明する最適化された葉鞘接種法は、イネの葉鞘のために開発され、適用されている元のプロトコルから変更されています^6,8,36。これにより、広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、生きた植物細胞における真菌の成長と発生を直接かつ詳細に観察することができます。プロトコルはトウモロコシのコロニー...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiocam monochrome microscope camera	ZEISS	426560-9010-000	Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope	ZEISS	N/A	Allows live viewing and image/video capture of biological samples
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL	Thermo Fisher Scientific	75002431	Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid	Fisher Scientific	08-757-105	Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper	Fisher Scientific	09-920-115	Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope	Olympus	N/A	For visualization of fungal transformants'
Germination paper	Anchor Paper Co.	SD7615L	76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes	VWR International	75845-542	Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool	Ohio Valley Specialty Chemical	3350	For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass	VWR International	15170-172	0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips	Fisher Scientific	12-553-457	Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds	West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada	CN361	Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	1.5 mL capacity
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-123	Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)	VWR International	255210	Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish	Revlon	43671	Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate	USA Sientific	1402-9500	100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-5390	Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective	Olympus	1-UB933	Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)	VWR International	90000-758	Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX	Premium Horticulture Supply Co.	N/A	Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers	Greenhouse Megastore	CN-SS-SC-10B	1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray	Greenhouse Megastore	CN-SS-SCTR98	24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade	Thermo Fisher Scientific	17-989-145	AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure	Target	002-02-0405	Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity