Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

Resumen

En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.

Resumen

Hemos optimizado un protocolo para inocular vainas foliares de maíz con hongos patógenos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. El método es una modificación de uno aplicado originalmente a las vainas de las hojas de arroz y permite la observación microscópica directa del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas. Las vainas foliares recolectadas de plántulas de maíz con dos collares foliares completamente emergidos se inoculan con 20 μL de suspensiones de esporas fúngicas de 5 x 10⁵ esporas/mL y se incuban en cámaras de humedad a 23 °C bajo luz fluorescente continua. Después de 24-72 h, el exceso de tejido se elimina con una cuchilla de afeitar para dejar una sola capa de células epidérmicas, una muestra ópticamente clara que se puede obtener directamente sin necesidad de fijación química o aclaramiento. Las células vegetales y fúngicas permanecen vivas durante la duración del experimento y las interacciones se pueden visualizar en tiempo real. Las vainas pueden teñirse o someterse a plasmólisis para estudiar la citología del desarrollo y la viabilidad de las células huésped y patógena durante la infección y la colonización. Las cepas fúngicas transformadas para expresar proteínas fluorescentes pueden ser inoculadas o co-inoculadas en las vainas para aumentar la resolución y facilitar la evaluación de interacciones competitivas o sinérgicas. Las cepas fúngicas que expresan proteínas de fusión fluorescentes se pueden utilizar para rastrear y cuantificar la producción y el objetivo de estas proteínas individuales en la planta. Los tejidos de la vaina inoculados se pueden extraer para caracterizar ácidos nucleicos, proteínas o metabolitos. El uso de estos ensayos de vaina ha hecho avanzar en gran medida los estudios detallados de los mecanismos de patogenicidad fúngica en el maíz y también de los efectores proteicos fúngicos y los metabolitos secundarios que contribuyen a la patogenicidad.

Introducción

Los análisis espaciales y temporales a nivel celular son fundamentales para comprender la fisiología y la citología de las interacciones entre hongos y plantas. Los tejidos foliares que han sido fijados químicamente ^1,2,3 o aclarados y teñidos⁴, así como las membranas artificiales^5, se han utilizado en el pasado para investigar la citología del desarrollo de patógenos foliares y las interacciones planta-hongo. Sin embargo, la investigación de eventos de infección en tejidos vivos del huésped en tiempo real sin fijación o aclaram....

Protocolo

NOTA: El flujo de trabajo del método se muestra en la Figura 1.

Figura 1: Pasos del protocolo de inoculación optimizado utilizando vainas de hojas de maíz desprendidas. La preparación de la suspensión de esporas, la inoculación de la vaina foliar y la preparación de la muestra para la microscopía de células vivas se resaltan en los cuadros verde (A), púrpura (B) y nar....

Discusión

El método optimizado de inoculación de la vaina foliar descrito aquí es una modificación de un protocolo original que se desarrolló y se ha aplicado a las vainas foliares de arroz ^6,8,36. Permite observaciones directas y detalladas del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas con microscopía de campo amplio o confocal. El protocolo es adecuado para la caracterización, comparación y cuantificación d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiocam monochrome microscope camera	ZEISS	426560-9010-000	Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscope	ZEISS	N/A	Allows live viewing and image/video capture of biological samples
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL	Thermo Fisher Scientific	75002431	Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lid	Fisher Scientific	08-757-105	Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper	Fisher Scientific	09-920-115	Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscope	Olympus	N/A	For visualization of fungal transformants'
Germination paper	Anchor Paper Co.	SD7615L	76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishes	VWR International	75845-542	Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool	Ohio Valley Specialty Chemical	3350	For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass	VWR International	15170-172	0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslips	Fisher Scientific	12-553-457	Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seeds	West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada	CN361	Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	1.5 mL capacity
Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-123	Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)	VWR International	255210	Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polish	Revlon	43671	Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plate	USA Sientific	1402-9500	100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-5390	Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective	Olympus	1-UB933	Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)	VWR International	90000-758	Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BX	Premium Horticulture Supply Co.	N/A	Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers	Greenhouse Megastore	CN-SS-SC-10B	1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers tray	Greenhouse Megastore	CN-SS-SCTR98	24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor blade	Thermo Fisher Scientific	17-989-145	AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closure	Target	002-02-0405	Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity