توليد نماذج إصابة الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus

Summary

لقد قمنا بتطوير العديد من البروتوكولات للحث على تلف الشبكية أو تنكس الشبكية في الضفادع الصغيرة Xenopus laevis . توفر هذه النماذج إمكانية دراسة آليات تجديد الشبكية.

Abstract

الأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين هي الأسباب الرئيسية للعمى. من بين العديد من الاستراتيجيات العلاجية التي يتم استكشافها ، ظهر تحفيز الإصلاح الذاتي مؤخرا على أنه جذاب بشكل خاص. المصدر الخلوي المهم لإصلاح الشبكية هو خلية مولر الدبقية ، التي تؤوي إمكانات الخلايا الجذعية وقدرة تجددية غير عادية في anamniotes. ومع ذلك ، فإن هذه الإمكانات محدودة للغاية في الثدييات. يجب أن توفر دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجديد الشبكية في النماذج الحيوانية ذات القدرات التجديدية نظرة ثاقبة حول كيفية إطلاق العنان للقدرة الكامنة لخلايا مولر الثديية على تجديد شبكية العين. هذه خطوة أساسية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية في الطب التجديدي. لتحقيق هذا الهدف ، قمنا بتطوير العديد من نماذج إصابة الشبكية في Xenopus: إصابة ميكانيكية في الشبكية ، وخط معدل وراثيا يسمح بالاستئصال الشرطي لمستقبلات الضوء بوساطة النيتروريدوكتاز ، ونموذج التهاب الشبكية الصباغي القائم على خروج المغلوب رودوبسين بوساطة كريسبر / كاس 9 ، ونموذج سام للخلايا مدفوع بحقن CoCl₂ داخل العين. تسليط الضوء على مزاياها وعيوبها ، وصفنا هنا هذه السلسلة من البروتوكولات التي تولد حالات تنكسية مختلفة وتسمح بدراسة تجديد الشبكية في Xenopus.

Introduction

يعاني ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم من أمراض تنكسية مختلفة في شبكية العين تؤدي إلى العمى ، مثل التهاب الشبكية الصباغي أو اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). حتى الآن ، لا تزال هذه الحالات غير قابلة للعلاج إلى حد كبير. تشمل الأساليب العلاجية الحالية قيد التقييم العلاج الجيني ، وزرع الخلايا أو الأنسجة ، والعلاجات الوقائية العصبية ، وعلم البصريات الوراثي ، والأجهزة التعويضية. وتستند استراتيجية ناشئة أخرى إلى التجديد الذاتي من خلال تنشيط الخلايا الداخلية ذات إمكانات الخلايا الجذعية. خلايا مولر الدبقية ، نوع الخلايا الدبقية الرئيسي في شبكية العين ، هي من بين المصادر الخلوية ذات الأهمية في هذا السياق. عند الإصابة ، يمكنهم إلغاء التمايز والتكاث....

Protocol

تم إجراء رعاية وتجربتها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ، بموجب A91272108 الترخيص المؤسسي. تمت الموافقة على بروتوكولات الدراسة من قبل لجنة رعاية المؤسسية CEEA # 59 وحصلت على إذن من الإدارة الإدارية لحماية السكان تحت الرقم المرجعي APAFIS # 32589-2021072719047904 v4 و APAFIS # 21474-2019071210549691 v2. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذه البروتوكولات.

1. إصابة الشبكية الميكانيكية

ملاحظة: يتكون بروتوكول نموذج الإصابة الموصوف هنا من ثقب ميكانيكي في شبكية الشرغوف من المرحلة 45 فصاعدا. لذلك ، لا يستهدف أي نوع معين من خلايا الشبكي....

النتائج

إصابة الشبكية الميكانيكية
تظهر أقسام شبكية العين من الضفادع الصغيرة المعرضة للإصابة الميكانيكية الموصوفة في قسم البروتوكول 1 أن آفة الشبكية تشمل جميع طبقات الأنسجة بينما تظل محدودة بموقع البزل (الشكل 2 أ ، ب).

الاجتثاث الشرطي لخلية ا.......

Discussion

مزايا وعيوب نماذج إصابة الشبكية المختلفة في الضفادع الصغيرة Xenopus

إصابة الشبكية الميكانيكية
تم تطوير إصابات جراحية مختلفة في شبكية العين العصبية في الضفادع الصغيرة Xenopus. قد تتم إزالة الشبكية العصبية بالكامل 15,16 أو استئصالها جزئيا^{فقط 1.......}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325