Generación de modelos de lesiones retinianas en renacuajos de Xenopus

Resumen

Hemos desarrollado varios protocolos para inducir daño retiniano o degeneración retiniana en renacuajos de Xenopus laevis . Estos modelos ofrecen la posibilidad de estudiar los mecanismos de regeneración de la retina.

Resumen

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son las principales causas de ceguera. Entre las numerosas estrategias terapéuticas que se están explorando, la estimulación de la autorreparación ha surgido recientemente como particularmente atractiva. Una fuente celular de interés para la reparación de la retina es la célula glial de Müller, que alberga potencial de células madre y una extraordinaria capacidad regenerativa en los anamniotas. Sin embargo, este potencial es muy limitado en los mamíferos. El estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración de la retina en modelos animales con capacidades regenerativas debería proporcionar información sobre cómo desbloquear la capacidad latente de las células de Müller de mamíferos para regenerar la retina. Este es un paso clave para el desarrollo de estrategias terapéuticas en medicina regenerativa. Con este objetivo, desarrollamos varios paradigmas de lesión retiniana en Xenopus: una lesión retiniana mecánica, una línea transgénica que permite la ablación condicional de fotorreceptores mediada por nitroreductasa, un modelo de retinosis pigmentaria basado en la eliminación de rodopsina mediada por CRISPR/Cas9 y un modelo citotóxico impulsado por inyecciones intraoculares de CoCl₂ . Destacando sus ventajas y desventajas, describimos aquí esta serie de protocolos que generan diversas condiciones degenerativas y permiten el estudio de la regeneración retiniana en Xenopus.

Introducción

Millones de personas en todo el mundo padecen diversas enfermedades degenerativas de la retina que conducen a la ceguera, como la retinosis pigmentaria, la retinopatía diabética o la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Hasta la fecha, estas afecciones siguen siendo en gran medida intratables. Los enfoques terapéuticos actuales que se están evaluando incluyen la terapia génica, los trasplantes de células o tejidos, los tratamientos neuroprotectores, la optogenética y los dispositivos protésicos. Otra estrategia emergente se basa en la autorregeneración a través de la activación de células endógenas con potencial de células madre. Las células gliales de Müller, el principal tipo de célula glial de la retina, se encuentran entre las fuentes celulares de interés en este contexto. Al lesionarse, pueden desdiferenciarse, proliferar y generar neuronas ^1,2,3. Aunque este proceso es muy efectivo en el pez cebra o Xenopus, es en gran medida ineficiente en los mamíferos.

Sin embargo, se ha demostrado que los tratamientos apropiados con proteínas mitogénicas o la sobreexpresión de diversos factores pueden inducir la reentrada en el ciclo celular de la glía de Müller en mamíferos y, en algunos casos, desencadenar su posterior compromiso neurogénico 1,2,3,4,5. Sin embargo, esto sigue siendo en gran medida insuficiente para los tratamientos. Por lo tanto, es necesario aumentar nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración para identificar moléculas capaces de convertir de manera eficiente las propiedades de las células madre de Müller en nuevas estrategias terapéuticas celulares.

Con este objetivo, desarrollamos varios paradigmas de lesión en Xenopus que desencadenan la degeneración de las células de la retina. Aquí, presentamos (1) una lesión mecánica de la retina que no es específica del tipo de célula, (2) un modelo de ablación celular condicional y reversible utilizando el sistema NTR-MTZ que se dirige a los bastones, (3) un knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9, un modelo de retinosis pigmentaria que desencadena la degeneración progresiva de los bastones, y (4) un CoCl₂-modelo citotóxico inducido que, según la dosis, puede dirigirse específicamente a los conos o provocar una degeneración más amplia de las células de la retina. Destacamos las particularidades, ventajas y desventajas de cada paradigma.

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Protocolo

El cuidado y la experimentación de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con los lineamientos institucionales, bajo la licencia institucional A91272108. Los protocolos de estudio fueron aprobados por el comité institucional de cuidado animal CEEA #59 y recibieron la autorización de la Dirección Departamental de la Protección de las Poblaciones bajo el número de referencia APAFIS #32589-2021072719047904 v4 y APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en estos protocolos.

1. Lesión mecánica de la retina

NOTA: El protocolo de paradigma de lesión descrito aquí consiste en una punción mecánica de la retina de un renacuajo a partir del estadio 45. Por lo tanto, no se dirige a ningún tipo de célula de la retina en particular, sino que daña todo el grosor de la retina en el lugar de la punción.

1. Preparación del anestésico para renacuajos
   1. Prepare una solución madre al 10% de benzocaína. Para un volumen total de 10 ml, agregue 1 g de benzocaína, 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y 8 ml de propilenglicol. Conserve la solución madre durante varios meses a 4 °C protegida de la luz con papel de aluminio.
   2. Prepare la solución de benzocaína al 0,005 % en el momento de su uso añadiendo 25 μl de solución madre de benzocaína al 10 % a 50 ml de agua de cría de renacuajos (agua del grifo filtrada y declorada). Mezclar bien.
      NOTA: La concentración de benzocaína es particularmente baja porque los renacuajos son muy sensibles a la anestesia en comparación con los adultos.
2. Preparación de pines
   1. Coloque un pasador estéril de 0,2 mm de diámetro en un soporte de pasador esterilizado (Figura 1A).
3. Anestesia renacuajo
   1. Usa una red de inmersión para atrapar renacuajos en sus tanques. Transfiéralos a un nuevo tanque que contenga la solución de benzocaína al 0,005%. Espere unos minutos hasta que los renacuajos dejen de reaccionar a los estímulos (golpeteo en el tanque o contacto directo).
      NOTA: Varios renacuajos pueden ser anestesiados simultáneamente, pero el tiempo de permanencia en la solución anestésica debe ser inferior a 30 min.
4. Punción retiniana
   1. Use una cuchara para atrapar un renacuajo y colóquelo con cuidado en una pequeña placa de Petri (55 mm de diámetro) que contenga un pañuelo húmedo. Coloca el renacuajo con el lado dorsal hacia arriba en el centro de la placa de Petri.
   2. Bajo un microscopio estereoscópico, perfore la retina insertando suavemente el alfiler en el lado dorsal del ojo, hasta que pase a través de la retina (Figura 1A). Si se necesitan varios pinchazos, repita este procedimiento en diferentes lugares. Después de perforar el ojo derecho, gire la placa de Petri 180° para perforar el ojo izquierdo.
   3. Transfiera el renacuajo lesionado a un tanque grande que contenga 1 L de agua de cría sumergiendo cuidadosamente la placa de Petri. Vigila a los renacuajos hasta que estén completamente despiertos.

2. Ablación condicional de bastones mediante el sistema NTR-MTZ

El protocolo tiene como objetivo inducir la ablación específica de los bastoncillos en la línea^{transgénica 6} de Xenopus Tg(rho:GFP-NTR), disponible en el servicio de zootecnia de TEFOR Paris-Saclay, que alberga el centro de recursos francés de Xenopus. Este sistema quimiogenético utiliza la capacidad de la enzima nitroreductasa (NTR) para convertir el profármaco metronidazol (MTZ) en un agente de reticulación de ADN citotóxico, para extirpar específicamente los bacilos que expresan NTR (Figura 1B). Anteriormente se han publicado dos protocolos detallados para producir animales transgénicos Tg(rho:GFP-NTR) o Tg(rho:NTR) e inducir la degeneración ^7,8. Aquí, simplemente detallamos la inducción de la degeneración de la retina y cómo monitorear el proceso de degeneración in vivo.

1. Preparación de la solución de metronidazol
   1. Preparar 10 mM de solución de MTZ en el momento de su uso disolviendo 1,67 g de polvo de MTZ en un frasco oscuro en 1 L de agua de cría de renacuajos que contenga 0,1% de DMSO, utilizando una barra agitadora magnética y un agitador magnético.
      NOTA: MTZ es sensible a la luz. La disolución completa puede tardar hasta 10 minutos.
2. Generación de renacuajos transgénicos por apareamiento natural a partir de la línea Tg(rho:GFP-NTR)
   NOTA: Dado que los machos transgénicos representan un stock precioso, preferimos generar embriones a través del apareamiento natural para no sacrificar al macho y usarlo repetidamente.
   1. Administración de hormonas
      1. Inyecte 600 UI de hormona gonadotropina coriónica humana (hCG) con agujas de 25G en el saco linfático dorsal de hembras de tipo salvaje de Xenopus laevis . Inyectar machos transgénicos con 100-200 UI de hCG en el saco linfático dorsal. Para el monitoreo en vivo de la degeneración de los bastones (paso 2.4), utilice Xenopus albinos en lugar de pigmentados, para visualizar mejor las variaciones de fluorescencia a través del ojo de los renacuajos transgénicos generados.
         NOTA: Las hembras de Xenopus se pueden preparar con 50 UI de hCG de 1 a 7 días antes de la ovulación planificada, pero esto es opcional.
   2. Apareamiento y recolección de huevos
      1. Inmediatamente después de la inyección de hCG, poner en un tanque un macho transgénico Tg(rho:GFP-NTR) junto con una hembra inyectada en hCG a 20 °C hasta el día siguiente. Use un volumen grande (al menos 10 L) y agregue objetos pequeños para que los huevos se adhieran, de modo que los huevos no se dañen con los movimientos de los adultos. Al día siguiente, cuando las ranas ya no estén en amplexo, saque a los adultos del tanque y recoja los embriones.
   3. Crianza de embriones y renacuajos
      1. Estadio embriones y renacuajos de acuerdo con la tabla normal de desarrollo de Xenopus ⁹.
      2. Cría embriones en un tanque lleno de agua para la cría de renacuajos. A partir de la etapa 45, alimenta a los renacuajos con comida en polvo para alevines y oxigena el agua con un burbujeador. Agregue agua diariamente si es necesario para compensar la evaporación y cambie el agua de todo el tanque semanalmente.
         NOTA: Alternativamente, también es posible cambiar el 50% del volumen dos veces por semana. Un protocolo detallado se puede encontrar en¹⁰.
   4. Clasificación de embriones transgénicos
      1. A partir del estadio 37/38, clasificar y seleccionar los embriones transgénicos bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia visualizando directamente la TFG (Figura 1C).
3. Tratamiento renacuajo MTZ
   1. Transfiera renacuajos transgénicos Tg(rho:GFP-NTR) a un tanque que contenga 10 mM de solución MTZ y críalos a 20 °C en oscuridad durante 1 semana. Utilice hermanos transgénicos criados en agua de cría de renacuajos que contengan 0,1% de DMSO como controles.
   2. Cambie la MTZ y la solución de control cada dos días durante el período de tratamiento. Alimente a los renacuajos como de costumbre durante el tratamiento MTZ.
   3. Para la monitorización individual de la fluorescencia (paso 2.4), coloque cada renacuajo en su recipiente pequeño con 30 ml de MTZ o solución de control a partir del paso 2.3.1.
      NOTA: El tratamiento con MTZ se puede realizar en cualquier momento a partir de la etapa 45.
4. Monitorización en directo de la degeneración de los bastones
   NOTA: La degeneración progresiva de las varillas se puede monitorizar en tiempo real. Por lo tanto, realice los pasos 2.4.1. a 2.4.4. antes del tratamiento con MTZ y luego regularmente después del tratamiento.
   1. Siga los pasos 1.1 y 1.3 para la preparación del anestésico y la anestesia renacuajo, respectivamente.
   2. Use una cuchara para atrapar un renacuajo y colóquelo con cuidado sobre un pañuelo húmedo en una placa de Petri pequeña (55 mm de diámetro). Observe la fluorescencia de GFP bajo un microscopio estereoscópico fluorescente (longitud de onda de excitación = 488 nm y longitud de onda de emisión = 509 nm) y tome fotografías del ojo. Una disminución de la intensidad de la fluorescencia refleja la degradación de los bastones.
      NOTA: Para realizar comparaciones cuantitativas, se deben mantener los mismos ajustes para obtener imágenes de todos los renacuajos.
   3. Transfiera el renacuajo fotografiado a un tanque grande que contenga 1 litro de agua de cría sumergiendo cuidadosamente la placa de Petri. Vigila a los renacuajos hasta que estén completamente despiertos.
   4. Comparar la intensidad de fluorescencia entre los ojos de renacuajo tratados con MTZ y los de control para monitorizar y evaluar la eficacia del proceso de degeneración.

3. Degeneración de los bastones por eliminación de rodopsina mediada por CRISPR/Cas9

NOTA: Este protocolo se establece para generar un modelo de retinosis pigmentaria en Xenopus laevis mediante la inducción de una degeneración específica de los bastones utilizando el knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9. El % de inserción-deleción (indels) en F0 se proporciona en¹¹ y es ~75%. Este knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 también se puede realizar en renacuajos de Xenopus tropicalis ¹¹.

1. Preparación de soluciones y reactivos
   1. Ordenamiento de crRNA y tracrRNA
      1. Compre el ARN sintético CRISPR (crRNA) dirigido al gen de la rodopsina (rho) y el crRNA transactivador estándar (tracrRNA). El crRNA está compuesto por una región específica de la diana rho (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) y otra (GUUUUAGAGCUAUGCU) que se hibrida con el tracrRNA.
   2. crRNA:tracrRNA dúplex (rho gRNA dúplex)
      1. Resuspender el crRNA y el tracrRNA a 100 μM en el tampón dúplex libre de nucleasas.
      2. Prepare el dúplex de ARNg mezclando 3 μL de 100 μM de ARNr rho, 3 μL de 100 μM de ARNtrac y 94 μL de tampón dúplex. Las concentraciones finales son 36 ng/μL rho crRNA y 67 ng/μL tracrRNA.
      3. Recocer los oligonucleótidos calentándolos a 95 °C durante 5 min y enfriarlos lentamente a temperatura ambiente. Hacer alícuotas y guardarlas a -20 °C.
   3. Complejo de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9 (es decir, dúplex de ARNg/proteína Cas9)
      1. En el momento de su uso, prepare la mezcla de rho gRNA dúplex y la proteína Cas9. Para 20 μL, añadir 10 μL de la solución dúplex de ARNg rho , 2 μL de proteína Cas9 (caldo a 5 mg/mL), 2 μL de fluoresceína lisina dextrano (caldo a 10 mg/mL) y 6 μL de agua libre de RNasa.
      2. Para formar el complejo de ribonucleoproteínas, incubar durante 10 minutos a 37 °C y dejar enfriar la solución a temperatura ambiente.
      3. Para 20 μL de la solución de control, mezcle 2 μL de proteína Cas9, 2 μL de fluoresceína lisina dextrano y 16 μL de agua libre de RNasa.
   4. Preparación de soluciones MBS 10x, 1x y 0.1x
      1. Prepare la solución madre salina de Barth modificada (10x MBS) agregando 11,92 g de HEPES, 51,43 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,75 g de cloruro de potasio (KCl), 2,1 g de bicarbonato de sodio (NaHCO₃) y 2,46 g de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO₄, 7 H₂O) en 800 ml de agua tipo II. Ajuste el pH a 7,8 con hidróxido de sodio (NaOH) al 30%. Agregue agua tipo II hasta que el volumen sea de 1 L y esterilice en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
      2. Preparar 1 L de solución 1x MBS diluyendo 100 mL de solución salina 10x MBS y 7 mL de cloruro de calcio 0,1 M dihidratado (CaCl 2, 2H₂O) en agua tipo II. Almacenar a temperatura ambiente.
      3. Prepare una solución de 0,1x MBS diluyendo 1x solución de MBS en agua de tipo II. Almacenar a temperatura ambiente.
   5. Solución de benzocaína para adultos
      1. Prepare la solución de benzocaína al 0,05 % añadiendo 5 ml de solución madre de benzocaína al 10 % (véase el paso 1.1.1.) a 1 litro de agua de cría de renacuajos. Mezclar bien.
         NOTA: Conserve esta solución durante varios meses a 4 °C protegida de la luz con papel de aluminio. Lleve la solución a temperatura ambiente antes de usarla en animales.
   6. Solución de L-cisteína
      1. Prepare la solución desgelatinizante en el momento de su uso añadiendo 2 g de L-cisteína clorhídrico monohidratado a 100 ml de solución 0,1x MBS. Ajusta el pH a 7,8 con un 30% de NaOH.
   7. Solución de polisacarosa
      1. Prepare la solución densa de polisacarosa añadiendo 3 g de polisacarosa a 100 ml de solución 0,1x MBS. Conservar esta solución durante unas semanas a 4 °C.
2. Fecundación in vitro y desevelación
   NOTA: Se pueden encontrar más detalles sobre la fertilización in vitro de Xenopus en un protocolo específico detallado en¹².
   1. Administración de hormonas a hembras de Xenopus laevis para inducir la ovulación
      1. Aproximadamente 15 h antes de la extracción de ovocitos, inyectar 600 UI de hCG en el saco linfático dorsal de la hembra y mantenerlo durante la noche a 18 °C.
   2. Disección de testículos
      1. Eutanasiar al macho de Xenopus con una dosis letal de solución de benzocaína al 0,05% durante 10-15 min. Como método complementario de eutanasia, cortar la columna vertebral inmediatamente posterior al cráneo con unas tijeras afiladas y resistentes. Abra la cavidad abdominal con unas tijeras de disección, corte los testículos y recorte la grasa y los capilares adheridos. Coloque cada testículo inmediatamente en hielo en 1 ml de 1x MBS.
   3. Preparación de espermatozoides
      1. Triturar un testículo con un mortero para tubos de microcentrífuga y diluir la suspensión en un tubo de 15 ml que contenga 9 ml de 1x MBS. Añadir 10 μg/ml de gentamicina al segundo tubo testicular y mantenerlo a 4 °C durante unos días para realizar más experimentos de fertilización.
   4. Fecundación in vitro
      1. Masajear suavemente la espalda de la hembra inyectada de hormonas y recoger los ovocitos en una placa de Petri (100 mm de diámetro). Esparce unas gotas de la solución espermática sobre los ovocitos. Espere 5 minutos y cúbralos con 0.1x MBS. Espere 10 minutos antes de continuar con el desvelado.
   5. Dejellying de óvulos fecundados
      1. Reemplace la solución 0.1x MBS con la solución de desgelatina para eliminar la capa de gelatina de los huevos fertilizados (~ 5 min). Enjuague bien los embriones 5-6 veces con 0,1x MBS y transfiéralos a una nueva placa de Petri de 100 mm llena de 0,1x MBS.
3. Preparación del sistema de microinyección
   1. Afile los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas¹³.
   2. Llene un capilar afilado con 2-10 μL de complejo de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 o la solución de control con una punta de microcargador y coloque el capilar en el manipulador de microinyectores.
   3. Con el aumento más alto de un microscopio estereoscópico, rompa la punta capilar con pinzas finas y ajuste el tiempo de inyección (~400 ms) para obtener un volumen de eyección de 10 nL por pulso. Ajuste la presión de eyección a alrededor de 40 PSI.
4. Microinyección de embriones en una célula con el complejo de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9
   1. Coloque los embriones en etapa de una célula en una rejilla (tejido de nailon de 1 mm) pegada en una placa de Petri de 100 mm llena de solución de polisacarosa al 3% (Figura 1D).
   2. Utilizando el microinyector y bajo un microscopio estereoscópico, inyectar 10 nL del complejo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 (que corresponde a 500 pg de gRNA dúplex + 5 ng de proteína Cas9 por embrión) o solución control a nivel del polo animal, en la región cortical, justo debajo de la membrana citoplasmática.
      NOTA: La fluoresceína lisina dextrano contenida en la solución permite la clasificación posterior de los embriones inyectados.
   3. Transferir los embriones inyectados a una nueva placa de Petri de 100 mm que contenga una solución limpia de polisacarosa y colocarlos a 21 °C.
   4. El primer día, clasifique regularmente los embriones bien desarrollados y reemplace la solución de polisacarosa con MBS 0.1x alrededor de 5 h después de la microinyección.
   5. Espere 24 h después de la inyección para clasificar y seleccionar los embriones crujientes rho bien inyectados bajo un microscopio estereoscópico fluorescente visualizando fluoresceína lisina dextrano (Figura 1E).
      NOTA: Cuanto antes se realice la microinyección después de la fertilización, más eficaz será el knockout.
5. Crianza de embriones y renacuajos
   1. Criar embriones rho crispantes en 0.1x MBS en placas de Petri hasta la etapa 37/38. Retire los embriones muertos diariamente y cambie la solución de MBS 0.1x. A partir de la etapa 37/38, cría los embriones en un tanque lleno de agua para la cría de renacuajos, y a partir de la etapa 45 proceda como en el paso 2.2.3.

4. Degeneración de células retinianas por inyecciones intraoculares citotóxicas de CoCl ₂

NOTA: Este protocolo se establece para inducir la degeneración celular de la retina mediante inyecciones intraoculares de cloruro de cobalto (CoCl₂) en renacuajos de Xenopus laevis . Según la dosis, puede desencadenar una degeneración específica del cono o una degeneración más amplia¹⁴. Utilizamos este protocolo en renacuajos de Xenopus laevis a partir de los 48 años. También se puede utilizar en renacuajos de Xenopus tropicalis .

1. Preparación de tampones y reactivos
   1. Prepare la solución de benzocaína al 0,005% en el momento de su uso como en el paso 1.1.
   2. Prepare 100 mM de solución madre de CoCl₂ añadiendo 118,5 mg a 5 mL de 0,1x MBS (consulte el paso 3.1.4 para preparar 0,1x MBS). Conserve esta solución madre durante varios meses a 4 °C, protegida de la luz con papel de aluminio.
      PRECAUCIÓN: El CoCl₂ está clasificado como un compuesto tóxico para la vida humana y animal. Siga cuidadosamente las instrucciones de manipulación, almacenamiento y eliminación de residuos de la hoja de datos de seguridad.
   3. Para la degeneración específica del cono, prepare una solución de 10 mM de CoCl₂ en el momento de su uso a partir de la solución madre de 100 mM diluida en 0,1x MBS. Para una degeneración más amplia de las células de la retina, prepare una solución de 25 mM de CoCl₂ .
2. Preparación del sistema de inyección
   1. Afile los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas ¹³.
   2. Llene un capilar afilado con 2-10 μL de solución de 10 o 25 mM de CoCl₂ o la solución de control (0,1x MBS) con una punta de microcargador y coloque el capilar en el manipulador de microinyectores.
   3. Con el aumento más alto de un microscopio estereoscópico, rompa la punta capilar con pinzas finas y ajuste el tiempo de inyección (aproximadamente 100 ms) para obtener un volumen de eyección de 15-40 nL por pulso. Ajuste la presión de eyección a ~40 PSI.
      NOTA: El tamaño de la gota debe adaptarse a la etapa de los renacuajos y al tamaño de su ojo. Por ejemplo, en las etapas 48-49, el tamaño de la gota es de ~15-20 nL, mientras que es de 30-40 nL en las etapas 52-56. Visualmente, el tamaño de la gota es un poco más grande que el tamaño de la lente.
3. Inyecciones intraoculares de CoCl₂
   1. Usa una red de inmersión para atrapar renacuajos en sus tanques. Transfiéralos a 50 ml de solución de benzocaína al 0,005%. Espera unos minutos hasta que los renacuajos dejen de reaccionar a los estímulos.
      NOTA: Varios renacuajos pueden ser anestesiados al mismo tiempo, pero el tiempo de anestesia debe ser inferior a 30 min.
   2. Use una cuchara para atrapar un renacuajo y colóquelo con cuidado en una pequeña placa de Petri (55 mm de diámetro) que contenga un pañuelo húmedo. Coloque el renacuajo con el lado dorsal hacia arriba en el centro de la placa de Petri (Figura 1F, G).
   3. Utilice el microinyector bajo un microscopio estereoscópico para inyectar intraocularmente la solución de CoCl₂ . Inserte suavemente el capilar en el ojo por encima del cristalino. Cuando la punta capilar esté dentro del ojo, expulse dos gotas por ojo. Después de inyectar el ojo derecho, gire la placa de Petri manualmente 180° para inyectar el ojo izquierdo.
      NOTA: Asegúrese de que la inyección se realice dentro del ojo, por lo que se debe ver una ligera hinchazón del ojo después de cada eyección de la solución. El renacuajo debe permanecer fuera del agua lo menos posible. La inyección de ambos ojos debe durar menos de 1 minuto.
   4. Transfiera el renacuajo inyectado a un tanque grande que contenga 1 L de agua de cría sumergiéndolo cuidadosamente en la placa de Petri (Figura 1H). Vigila a los renacuajos hasta que estén completamente despiertos.

5. Tinción para evaluar el daño o la degeneración de la retina

1. Fijación y deshidratación de renacuajos
   1. Prepare una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% diluyendo 100 ml de solución de PFA al 32% en 700 ml de 1x PBS. Ajusta el pH a 7,4 con NaOH. Aliquotar esta solución madre y conservarla durante varios meses a -20 °C.
   2. Eutanasiar los renacuajos en benzocaína al 0,01% y transferirlos a un vial que contenga PFA al 4% durante 2 h a temperatura ambiente con agitación o durante la noche a 4 °C. Enjuague 3 x 5 min en 1x PBS.
   3. Deshidratar progresivamente renacuajos mediante incubaciones sucesivas de 30 min en etanol al 70% y 95% (diluido en agua tipo II), seguidas de tres incubaciones más de 1 h en etanol al 100%. Guarde las cabezas de renacuajo en este paso a -20 ° C o transfiéralas directamente a butanol al 100% durante la noche para pasos posteriores.
2. Seccionamiento de parafina
   1. Sustituir el butanol al 100% por parafina derretida durante 2 h a 62 °C. Sustituir la parafina durante 2 x 2 h de incubaciones adicionales a 62 °C.
   2. Transfiera las cabezas de renacuajo en moldes de inclusión de parafina desechables y oriéntelos para que sus ojos estén bien alineados, y luego deje que la parafina se endurezca. Guarde los bloques a temperatura ambiente.
   3. Recorta el exceso de parafina y monta el bloque con los renacuajos incrustados en el soporte del micrótomo.
   4. Seccionar el bloque con un micrótomo con el grosor adecuado (10-12 μm). Transfiera las cintas con secciones en un portaobjetos previamente cubierto con albúmina de glicerina al 3% (diluida en agua).
   5. Coloque el portaobjetos en un calentador de portaobjetos a 42 °C durante unos minutos y luego retire el exceso de glicerina albúmina. Deje secar los portaobjetos durante la noche en un horno a 37 °C.
   6. Desparafinar sumergiendo los portaobjetos durante 2 x 15 minutos en un frasco Coplin lleno de xileno al 100%. Rehidratar las secciones con series de etanol graduadas: 100% dos veces, 70%, 50% (diluido en agua tipo II), ~ 5 min cada una, seguido de 2 x 5 min en agua.
3. Marcaje de inmunofluorescencia
   1. Preparar 100 mM de solución madre de citrato sódico (CiNa) añadiendo 29,4 g de citrato sódico trisódico dihidratado (C₆H₅Na₃O₇, 2H₂O) a 1 L de agua tipo II; ajuste el pH a 6 con ácido clorhídrico (HCl). Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente durante varios meses. Prepare la solución de desenmascaramiento en el momento de su uso añadiendo 25 ml de solución madre de CiNa de 100 mM a 225 ml de agua tipo II. Añadir 125 μL de Tween-20 y mezclar bien (la concentración final es de 10 mM de CiNa, 0,05% de Tween-20).
   2. Prepare la solución madre de Hoechst a 10 mg/ml añadiendo 100 mg de bisbenzimida H 33258 a 10 ml de agua tipo I. Conserve esta solución madre durante varios meses a 4 °C, protegida de la luz con un papel de aluminio. Prepare la solución de Hoechst a 7,5 μg/ml añadiendo 300 μl de solución madre de Hoechst a 400 ml de 1x PBS.
      NOTA: Esta solución puede utilizarse hasta 10 veces y conservarse durante unos 6 meses a 4 °C, protegida de la luz con papel de aluminio.
   3. Después de desparafinar las secciones, realice la recuperación del antígeno hirviendo las secciones en la solución de desenmascaramiento durante 9 min. Deje que la solución se enfríe durante 20 minutos.
   4. Enjuague una vez en agua tipo II y una vez en 1x PBS. Coloque los portaobjetos planos en una cámara húmeda y agregue 400-600 μL de solución de bloqueo por portaobjetos (diluyente de anticuerpos + 0,2% Triton X100) durante 30 min.
   5. Sustituir la solución de bloqueo por 200 μL por portaobjetos del anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo. Use un cubreobjetos para esparcir la solución sobre las secciones, evitando la formación de burbujas. Incubar durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda.
   6. Transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin y enjuague durante 3 x 10 min en 1x PBS suplementado con Triton X100 al 0,1 %. Colocar los portaobjetos planos, añadir 400 μL por portaobjetos del anticuerpo secundario diluido en solución bloqueante y dejar actuar durante 2 h a temperatura ambiente en una cámara húmeda.
   7. Transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin y enjuague durante 3 x 5 minutos con 1x PBS complementado con Triton X100 al 0,1%.
   8. Contratiñir los núcleos celulares con la solución de Hoechst durante 10 minutos y enjuagar 3 x 5 minutos con 1x PBS.
   9. Coloque los cubreobjetos sobre los portaobjetos en un medio de montaje acuoso diseñado específicamente para preservar la fluorescencia. Deje secar los portaobjetos durante 1 h a temperatura ambiente y guárdelos a 4 °C.
   10. Tome imágenes de los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia.
4. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar el daño retiniano
   NOTA: En lugar de etiquetar un tipo de célula en particular mediante inmunotinción, la histología general de la retina se puede evaluar con coloración H&E.
   1. Después de desparafinar las secciones, realice el marcaje de ácidos nucleicos sumergiendo los portaobjetos en una solución de hematoxilina durante 2 minutos. Enjuague bien con agua del grifo.
   2. Realice el marcaje del citoplasma sumergiendo los portaobjetos en una solución de eosina al 1% durante 1 min. Enjuague rápidamente con agua.
      NOTA: La eosina es muy soluble; Si los toboganes se dejan demasiado tiempo en el agua, todo el tinte desaparece.
   3. Enjuague 2 x 5 min en etanol al 100% y 2 x 5 min en xileno.
   4. Debajo del capó, coloque cubreobjetos sobre los portaobjetos en 4-5 gotas de un medio de montaje. Deje que los portaobjetos se sequen bajo una capucha y tome imágenes al día siguiente con un microscopio.
5. Detección de células apoptóticas
   1. Después de las secciones de desparafinado (ver sección 5.2.6), siga el protocolo del fabricante del kit para detectar la fragmentación apoptótica del ADN.
   2. Realice la tinción de los núcleos sumergiendo los portaobjetos en la solución de Hoechst (ver sección 5.3.8) y móntelos con un medio de montaje acuoso diseñado específicamente para preservar la fluorescencia. Deje secar los portaobjetos durante 1 h a temperatura ambiente y guárdelos a 4 °C.
   3. Tome imágenes de los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia.

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Resultados

Lesión mecánica de la retina
Las secciones retinianas de renacuajos sometidos a la lesión mecánica descrita en la sección 1 del protocolo muestran que la lesión retiniana abarca todas las capas del tejido y se limita al lugar de punción (Figura 2A, B).

Ablación condicional de bastones mediante el sistema NTR-MTZ
Los ojos de renacuajos transgénicos Tg(rho:GFP-NTR) anestesiados tratados con t...

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Discusión

Ventajas y desventajas de varios paradigmas de lesión retiniana en renacuajos de Xenopus

Lesión mecánica de la retina
Se han desarrollado varias lesiones quirúrgicas de la retina neural en renacuajos de Xenopus. La retina neural puede ser extirpada por completo^15,16 o sólo parcialmente^{extirpada 16,17}. La lesión mecán...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325