JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성
요약
우리는 Xenopus laevis 올챙이의 망막 손상 또는 망막 변성을 유도하기 위한 몇 가지 프로토콜을 개발했습니다. 이 모델은 망막 재생 메커니즘을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다.
초록
망막 신경 퇴행성 질환은 실명의 주요 원인입니다. 연구되고 있는 수많은 치료 전략 중에서, 자가 회복을 자극하는 것이 최근 특히 매력적인 것으로 떠올랐다. 망막 복구를 위한 세포의 관심 원천은 뮐러 신경교세포(Müller glial cell)로, 줄기세포의 잠재력과 아남니오트의 놀라운 재생 능력을 가지고 있습니다. 그러나 이 잠재력은 포유류에서 매우 제한적입니다. 재생 능력이 있는 동물 모델에서 망막 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 연구하면 포유류 뮐러 세포의 망막 재생 잠재 능력을 잠금 해제하는 방법에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이는 재생 의학의 치료 전략 개발을 위한 핵심 단계입니다. 이를 위해 우리는 Xenopus에서 기계적 망막 손상, 니트로환원효소 매개 광수용체 조건부 절제를 허용하는 형질전환 라인, CRISPR/Cas9 매개 로돕신 녹아웃을 기반으로 하는 색소성 망막염 모델, 안구 내 CoCl2 주입에 의한 세포독성 모델 등 여러 망막 손상 패러다임을 개발했습니다. 장점과 단점을 강조하면서 다양한 퇴행성 조건을 생성하고 Xenopus의 망막 재생을 연구할 수 있는 이 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.
서문
전 세계 수백만 명의 사람들이 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성(AMD)과 같은 실명으로 이어지는 다양한 망막 퇴행성 질환으로 고통받고 있습니다. 현재까지 이러한 질환은 대부분 치료가 불가능한 상태로 남아 있습니다. 현재 평가 중인 치료 접근법에는 유전자 치료, 세포 또는 조직 이식, 신경 보호 치료, 광유전학 및 보철 장치가 포함됩니다. 또 다른 새로운 전략은 줄기 세포 잠재력을 가진 내인성 세포의 활성화를 통한 자가 재생을 기반으로 합니다. 망막의 주요 신경교세포(glial cell) 유형인 뮐러(Müller) 신경교세포(glial cell)는 이러한 맥락에서 관심의 세포 공급원 중 하나입니다. 손상을 입으면 분화, 증식 및 뉴런 1,2,3을 생성할 수 있습니다. 이 과정은 제브라피시나 제노푸스에서는 매우 효과적이지만 포유류에서는 대체로 비효율적입니다.
그럼에도 불구하고, 유사분열 단백질을 사용한 적절한 치료 또는 다양한 요인의 과발현이 포유류 뮐러 신경교세포 세포 주기 재진입을 유도할 수 있고, 어떤 경우에는 후속 신경 발생 헌신....
프로토콜
동물 관리 및 실험은 기관 면허 A91272108에 따라 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 기관 동물 관리 위원회 CEEA #59의 승인을 받았으며 참조 번호 APAFIS #32589-2021072719047904 v4 및 APAFIS #21474-2019071210549691 v2로 Direction Départementale de la Protection des Populations의 승인을 받았습니다. 이러한 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 기기 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 기계적 망막 손상
참고: 여기에 설명된 부상 패러다임 프로토콜은 올챙이 45단계부터 기계적 망막 천자로 구성됩니다. 따라서 특정 망막 세포 유형을 표적으로 삼는 것이 아니라 천자 부위의 망막 전체 두께를 손상시킵니다.
- 올챙이 마취제의 준비
- benzocaine의 10% 원액을 준비하십시오. 총 부피 10mL의 경우 벤조카인 1g, 디메틸설폭사이드(DMSO) 2mL, 프로필렌 글리콜 8mL를 추가합니다. 원액을 4°C에서 몇 달 동안 보존하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하십시오.....
대표적 결과
기계적 망막 손상
프로토콜 섹션 1에 설명된 기계적 손상을 입은 올챙이의 망막 절편은 망막 병변이 천자 부위에 국한된 상태로 유지되는 동안 조직의 모든 층을 포함한다는 것을 보여줍니다(그림 2A, B).
NTR-MTZ 시스템을 이용한 조건부 간상세포 절제
프로토콜 섹션 2에 설명된 대로 MTZ 처리로 처리된 마취된 Tg.......
토론
Xenopus 올챙이의 다양한 망막 손상 패러다임의 장점과 단점
기계적 망막 손상
신경 망막의 다양한 외과적 손상은 Xenopus 올챙이에서 발생했습니다. 신경 망막은 완전히 제거되거나 15,16 부분적으로만 절제될 수 있다16,17. 여기에 제시된 기계적 손상?.......
공개
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 말
이 연구는 ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé)과 협력하여 Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) 및 UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels)의 M.P. 보조금으로 지원되었습니다.
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
참고문헌
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. ....
재인쇄 및 허가
JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기
허가 살펴보기더 많은 기사 탐색
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유