Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

要約

私たちは、 Xenopus laevis オタマジャクシの網膜損傷または網膜変性を誘発するためのいくつかのプロトコルを開発しました。これらのモデルは、網膜再生メカニズムを研究する可能性を提供します。

要約

網膜神経変性疾患は失明の主な原因です。数多くの治療戦略が検討されている中で、最近、刺激的な自己修復が特に魅力的に浮上しています。網膜修復に関心のある細胞源はミュラーグリア細胞であり、幹細胞の可能性とアナムニオテスの並外れた再生能力を秘めています。しかし、この可能性は哺乳類では非常に限られています。再生能力を持つ動物モデルで網膜再生の根底にある分子メカニズムを研究することで、哺乳類ミュラー細胞の網膜再生能力を解き放つ方法についての洞察が得られるはずです。これは、再生医療における治療戦略の開発にとって重要なステップです。この目的のために、Xenopusでは、機械的網膜損傷、ニトロレダクターゼを介した光受容体条件付きアブレーションを可能にするトランスジェニックライン、CRISPR/Cas9を介したロドプシンノックアウトに基づく網膜色素変性症モデル、および眼内CoCl2注射によって駆動される細胞傷害モデルなど、いくつかの網膜損傷パラダイムを開発しました。それらの長所と短所を強調して、ここでは、さまざまな変性状態を生成し、Xenopusにおける網膜再生の研究を可能にするこの一連のプロトコルについて説明します。

概要

世界中の何百万人もの人々が、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)など、失明につながるさまざまな網膜変性疾患に苦しんでいます。今日まで、これらの状態はほとんど治療できないままです。現在評価されている治療法には、遺伝子治療、細胞または組織移植、神経保護治療、光遺伝学、補綴装置などがあります。もう一つの新たな戦略は、幹細胞の潜在能力を持つ内因性細胞の活性化による自己再生に基づいています。網膜の主要なグリア細胞型であるミュラーグリア細胞は、この文脈で関心のある細胞源の一つです。損傷を受けると、それらは脱分化、増殖、およびニューロンを生成することができます^1,2,3。このプロセスはゼブラフィッシュやゼノプスでは非常に効果的ですが、哺乳類ではほとんど非効率的です。

それにもかかわらず、分裂促進タンパク質またはさまざまな要因の過剰発現による適切な処理は、哺乳類ミュラーグリア細胞周期の再突入を誘発し、場合によっては、その後の神経新生コミットメントを引き起こす可能性があることが示されています1,2,3,4,5。しかし、これは治療にはほとんど不十分なままです。したがって、再生の根底にある分子メカニズムに関する知識を深めることは、ミュラー幹様細胞の特性を新しい細胞治療戦略に効率的に変換できる分子を特定するために必要です。

この目的のために、私たちは網膜細胞の変性を引き起こすいくつかの傷害パラダイムを Xenopus で開発しました。ここでは、(1)細胞型に特異的ではない機械的網膜損傷、(2)桿体細胞を標的とするNTR-MTZシステムを用いた条件付きおよび可逆的細胞アブレーションモデル、(3)CRISPR/Cas9を介した ロドプシン ノックアウト、進行性桿体細胞変性を引き起こす網膜色素変性症のモデル、 および(4)_CoCl2-用量に応じて、錐体を特異的に標的にしたり、より広範な網膜細胞変性を引き起こしたりできる誘導細胞傷害性モデル。各パラダイムの特殊性、長所、短所を強調します。

プロトコル

動物の飼育と実験は、施設のライセンスA91272108の下で、施設のガイドラインに従って行われました。研究プロトコルは、施設動物管理委員会CEEA #59によって承認され、参照番号APAFIS #32589-2021072719047904 v4およびAPAFIS #21474-2019071210549691 v2の下でDirection Départementale de la Protection des Populationsによって承認されました。これらのプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。

1.機械的網膜損傷

注:ここで説明する傷害パラダイムプロトコルは、ステージ45以降のオタマジャクシの機械的網膜穿刺で構成されています。したがって、特定の網膜細胞タイプを標的とするのではなく、穿刺部位の網膜の厚さ全体に損傷を与えます。

1. オタマジャクシの麻酔薬の調製
   1. ベンゾカインの10%ストック溶液を調製します。総容量が 10 mL になるように、ベンゾカイン 1 g、ジメチルスルホキシド(DMSO)2 mL、プロピレングリコール 8 mL を加えます。ストック溶液をアルミホイルで光から保護した4°Cで数ヶ月間保存してください。
   2. オタマジャクシ飼育用水(濾過・脱塩素処理した水道水)50mLに10%ベンゾカイン原液25μLを加えて使用時に0.005%ベンゾカイン溶液を調製する。よく混ぜます。
      注:オタマジャクシは成人に比べて麻酔に非常に敏感であるため、ベンゾカインの濃度は特に低くなっています。
2. ピンの準備
   1. 直径0.2mmの滅菌ピンを滅菌ピンホルダーに取り付けます(図1A)。
3. オタマジャクシ麻酔
   1. 水槽内のオタマジャクシを捕まえるためにディップネットを使用してください。0.005%ベンゾカイン溶液を含む新しいタンクに移します。オタマジャクシが刺激に反応しなくなるまで数分待ちます(タンクを叩くか、直接接触します)。
      注:複数のオタマジャクシを同時に麻酔することができますが、麻酔液に費やす時間は30分未満にする必要があります。
4. 網膜穿刺
   1. スプーンを使ってオタマジャクシを1匹捕まえ、ウェットティッシュを入れた小さなシャーレ(直径55mm)に慎重に置きます。オタマジャクシの背側をペトリ皿の真ん中に置きます。
   2. 実体顕微鏡下で、ピンを眼球の背側に静かに挿入し、網膜を貫通するまで網膜に穿刺します(図1A)。複数のポークが必要な場合は、この手順を別の場所で繰り返します。右目を穿刺した後、ペトリ皿を180°回して左目を穿刺します。
   3. 病変したオタマジャクシを、ペトリ皿を慎重に浸して、飼育水1Lの入った大きなタンクに移します。オタマジャクシが完全に目覚めるまで監視します。

2. NTR-MTZシステムを用いた条件付き桿体細胞切除

プロトコルはXenopus Tg (rho:GFP-NTR)のtransgenicライン⁶の特定の棒細胞の切除を誘導する、フランスのXenopusのリソースの中心を催すTEFORのパリSaclayの動物工学サービスで利用できる。この化学遺伝学的システムは、ニトロレダクターゼ(NTR)酵素の能力を利用して、プロドラッグメトロニダゾール(MTZ)を細胞傷害性DNA架橋剤に変換し、NTR発現桿体を特異的に切除します(図1B)。Tg(rho:GFP-NTR)またはTg(rho:NTR)トランスジェニック動物を作製し、変性を誘導する2つの詳細なプロトコル^{が以前に発表}されています^7,8。ここでは、網膜変性の誘導と、in vivoでの変性プロセスをモニターする方法について簡単に詳しく説明します。

1. メトロニダゾール溶液の調製
   1. 使用時に、0.1% DMSOを含む1Lのオタマジャクシ飼育水に1.67gのMTZ粉末をダークボトルに溶解し、磁気攪拌子と磁気攪拌機を使用して10 mM MTZ溶液を調製します。
      注意: MTZは光に敏感です。完全に溶解するには最大10分かかる場合があります。
2. Tg(rho:GFP-NTR)系統からの自然交配によるトランスジェニックオタマジャクシの作製
   注:トランスジェニックオスは貴重なストックであるため、オスを犠牲にせず、繰り返し使用するために、自然交配によって胚を生成することを好みます。
   1. ホルモン投与
      1. ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン(hCG)を25Gの針で600I.U.を Xenopus laevis 野生型メスの背側リンパ嚢に注射する。100〜200 I.U.のhCGをトランスジェニック男性に背側リンパ嚢に注入します。桿体変性のライブモニタリング(ステップ2.4)では、色素沈着したオタマジャクシではなくアルビノの Xenopus を使用して、生成されたトランスジェニックオタマジャクシの眼全体の蛍光の変化をよりよく視覚化します。
         注: Xenopus の女性は、計画された排卵の1〜7日前に50 I.U.のhCGでプライミングすることができますが、これはオプションです。
   2. 交尾と採卵
      1. hCG注入直後、 Tg(rho:GFP-NTR) トランスジェニックオス1匹とhCG注入メス1匹を翌日まで20°Cでタンクに入れた。大容量(少なくとも10L)を使用し、卵が付着する小さなものを追加して、大人の動きによって卵が損傷しないようにします。翌日、カエルが発作を起こしなくなったら、成虫を水槽から取り出し、胚を集めます。
   3. 胚とオタマジャクシの飼育
      1. 胚とオタマジャクシを Xenopus 発生の正常表に従ってステージングする⁹.
      2. オタマジャクシ飼育用水で満たされた水槽で胚を育てます。ステージ45から、オタマジャクシに粉末の稚魚を与え、バブラーで水に酸素を供給します。蒸発を補うために必要に応じて毎日水を追加し、タンク全体の水を毎週交換します。
         注:または、週に2回、ボリュームの50%を交換することもできます。詳細なプロトコルは¹⁰ にあります。
   4. トランスジェニック胚の選別
      1. ステージ37/38から、GFPを直接可視化することにより、蛍光実体顕微鏡下でトランスジェニック胚を選別および選択します(図1C)。
3. オタマジャクシMTZ治療
   1. Tg(rho:GFP-NTR)トランスジェニックオタマジャクシを10 mM MTZ溶液を含むタンクに移し、20°Cの暗所で1週間飼育します。0.1% DMSOを含むオタマジャクシ飼育水で飼育されたトランスジェニック兄弟を対照として使用します。
   2. 治療期間中は、MTZとコントロール溶液を1日おきに交換してください。MTZ治療中は、通常どおりオタマジャクシに餌を与えます。
   3. 個々の蛍光モニタリング(ステップ2.4)では、各オタマジャクシを30 mLのMTZまたはステップ2.3.1以降のコントロール溶液が入った小さな容器に入れます。
      注:MTZ治療は、ステージ45以降はいつでも実行できます。
4. ロッドの変性をライブで監視
   注:ロッドの進行性変性はリアルタイムで監視できます。したがって、手順2.4.1を実行します。を 2.4.4 に変更します。MTZ治療前、治療後も定期的に。
   1. ステップ1.1と1.3に従って、それぞれ麻酔薬とオタマジャクシ麻酔を準備します。
   2. スプーンを使ってオタマジャクシを1匹捕まえ、小さなペトリ皿(直径55 mm)のウェットティッシュに慎重に置きます。GFP蛍光を蛍光実体顕微鏡(励起波長=488nm、発光波長=509nm)で観察し、眼の写真を撮影する。蛍光強度の低下は、桿体の劣化を反映しています。
      注:定量的な比較を行うには、すべてのオタマジャクシのイメージングで同じ設定を維持する必要があります。
   3. 撮影したオタマジャクシを、ペトリ皿を丁寧に浸し、飼育水1Lの入った大きな水槽に移します。オタマジャクシが完全に目覚めるまで監視します。
   4. MTZ処理されたオタマジャクシの眼と対照のオタマジャクシの眼の蛍光強度を比較して、変性プロセスの有効性を監視および評価します。

3. CRISPR/Cas9を介した ロドプシン ノックアウトによる桿体細胞の変性

注:このプロトコルは、CRISPR/Cas9媒介ロドプシンノックアウトを使用して特定の桿体細胞変性を誘導することにより、Xenopus laevisの網膜色素変性症のモデルを生成するために確立されています。F0 の挿入欠失 (インデル) の % は¹¹ で提供され、~75% です。このようなCRISPR/Cas9を介したロドプシンノックアウトは、Xenopus tropicalisのオタマジャクシでも実施することができる¹¹。

1. 溶液および試薬の調製
   1. crRNAとtracrRNAの順序付け
      1. ロドプシン(rho)遺伝子を標的とする合成CRISPR RNA(crRNA)と、標準的なトランス活性化crRNA(tracrRNA)を購入してください。crRNAは、rho標的特異的領域(GCUCUGCUAAGUAAUACUGA)と、tracrRNAにハイブリダイズする別の領域(GUUUUAGAGCUAUGCU)から構成されています。
   2. crRNA:tracrRNA二本鎖(rho gRNA二本鎖)
      1. crRNA および tracrRNA をヌクレアーゼフリー二本鎖バッファーに 100 μM で再懸濁します。
      2. 3 μL の 100 μM rho crRNA、3 μL の 100 μM tracrRNA、94 μL の二本鎖バッファーを混合して、gRNA 二本鎖を調製します。最終濃度は、36 ng/μL の rho crRNA と 67 ng/μL の tracrRNA です。
      3. オリゴを95°Cで5分間加熱してアニーし、室温までゆっくりと冷却します。アリコートを作り、-20°Cで保存します。
   3. CRISPR-Cas9リボ核タンパク質複合体(すなわち、gRNA二本鎖/Cas9タンパク質)
      1. 使用時には、 二本鎖のrho gRNAとCas9タンパク質の混合物を調製してください。20 μL の場合、10 μL の rho gRNA 二本鎖溶液、2 μL の Cas9 タンパク質(ストック 5 mg/mL)、フルオレセインリジンデキストラン 2 μL(ストック 10 mg/mL)、RNase フリー水 6 μL を加えます。
      2. リボ核タンパク質複合体を形成するには、37°Cで10分間インキュベートし、溶液を室温まで冷却します。
      3. コントロール溶液20 μLに対して、Cas9タンパク質2 μL、フルオレセインリジンデキストラン2 μL、RNaseフリー水16 μLを混合します。
   4. 10倍、1倍、0.1倍のMBSソリューションの準備
      1. 11.92gのHEPES、51.43gの塩化ナトリウム(NaCl)、0.75gの塩化カリウム(KCl)、2.1gの重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、および2.46gの硫酸マグネシウム七水和物(MgSO₄、7 H₂O)を800 mLのタイプII水に添加して、Modified Barthの生理食塩水溶液(10x MBS)を調製します。30%水酸化ナトリウム(NaOH)でpHを7.8に調整します。体積が1LになるまでタイプIIの水を加え、オートクレーブ滅菌します。室温で保存してください。
      2. 10x MBS塩水溶液100 mLと0.1 M塩化カルシウム二水和物(CaCl 2、2H₂ O)7 mLをタイプII水で希釈して、1 Lの1x MBS溶液を調製します。室温で保存してください。
      3. 1x MBS溶液をタイプIIの水で希釈して、0.1x MBS溶液を調製します。室温で保存してください。
   5. 大人のためのBenzocaineの解決
      1. 1 Lのオタマジャクシ飼育用水に5 mLの10%ベンゾカイン原液(ステップ1.1.1を参照)を加えて、0.05%ベンゾカイン溶液を調製します。よく混ぜます。
         注意: この溶液は、アルミホイルで光から保護した4°Cで数か月間保存してください。動物に使用する前に、溶液を室温に戻してください。
   6. L-システイン溶液
      1. 使用時に0.1x MBS溶液100mLにL-システイン塩酸一水和物2gを加えて脱ゼリー液を調製する。pHを7.8%NaOHで30に調整します。
   7. ポリスクロース溶液
      1. 100 mLの0.1x MBS溶液に3gのポリスクロースを加えて、高密度ポリスクロース溶液を調製します。この溶液を4°Cで数週間保存します。
2. 体外 受精と脱ゼリー
   注: Xenopusの体外 受精の詳細については、¹²の詳細な専用プロトコルを参照してください。
   1. Xenopus laevis雌への排卵誘発ホルモン投与
      1. 卵母細胞採取の約15時間前に、600 I.U.のhCGを雌の背側リンパ嚢に注入し、18°Cで一晩保持します。
   2. 精巣解離
      1. 致死量の0.05%ベンゾカイン溶液で Xenopus 男性を10〜15分間安楽死させます。.補完的な安楽死方法として、鋭くて頑丈なハサミで頭蓋骨のすぐ後ろの脊椎を切断します。解剖ハサミで腹腔を開き、精巣を切り取り、付着した脂肪や毛細血管を切り取ります。各精巣を1x MBSの1 mLに直ちに氷上に置いてください。
   3. 精子の準備
      1. 微量遠心チューブ用の乳棒を使用して1つの精巣を粉砕し、9 mLの1x MBSを含む15 mLチューブで懸濁液を希釈します。10 μg/mL のゲンタマイシンを 2 番目の精巣チューブに加え、さらに受精実験を行うために 4 °C で数日間保持します。
   4. 体外 受精
      1. ホルモン注射した女性の背中を優しくマッサージし、ペトリ皿(直径100mm)に卵母細胞を採取します。精子溶液を数滴卵母細胞に広げます。5分待ってから、0.1倍のMBSで覆います。10分待ってから、デジェリーに進みます。
   5. 受精卵のデゼリー
      1. 0.1x MBS溶液を脱ゼリー溶液に置き換えて、受精卵からゼリーコートを取り除きます(~5分)。胚を0.1x MBSで5〜6回完全にすすぎ、0.1x MBSで満たされた新しい100 mmペトリ皿に移します。
3. マイクロインジェクションシステムの準備
   1. マイクロピペットプー^ラー13でガラス毛細管を研ぎます。
   2. シャープにしたキャピラリーに2〜10μLのCRISPR-Cas9リボ核タンパク質複合体またはマイクロローダーチップを使用したコントロール溶液を充填し、キャピラリーをマイクロインジェクターハンドラーに入れます。
   3. 実体顕微鏡の最高倍率で、微細な鉗子でキャピラリー先端を切断し、注入時間(~400 ms)を調整して、パルスあたり10 nLの吐出量を得ます。突出圧力を約 40 PSI に設定します。
4. CRISPR-Cas9リボ核タンパク質複合体を用いた1細胞段階胚マイクロインジェクション
   1. 3%ポリスクロース溶液で満たされた100 mmのペトリ皿に接着されたグリッド(1 mmのナイロン組織)に1細胞期の胚を配置します(図1D)。
   2. マイクロインジェクターを使用し、実体顕微鏡下で、10 nLのCRISPR-Cas9リボ核タンパク質複合体(胚あたり500 pgの二本鎖gRNA + 5 ngのCas9タンパク質に相当)または対照溶液を動物極のレベル、皮質領域、細胞質膜のすぐ下に注入します。
      注:溶液に含まれるフルオレセインリジンデキストランは、注入された胚のその後の選別を可能にします。
   3. 注入した胚を清潔なポリスクロース溶液を含む新しい100 mmペトリ皿に移し、21°Cに置いた。
   4. 初日は、よく発達した胚を定期的に選別し、マイクロインジェクションの約5時間後にポリスクロース溶液を0.1x MBSと交換します。
   5. 注入後24時間待って、フルオレセインリジンデキストランを可視化することにより、蛍光実体顕微鏡下で適切に注入された rho crispant胚を選別します(図1E)。
      注:受精後のマイクロインジェクションが早ければ早いほど、ノックアウトはより効果的です。
5. 胚とオタマジャクシの飼育
   1. ロークリスパント胚をペトリ皿で0.1x MBSでステージ37/38まで育てます。死んだ胚を毎日除去し、0.1x MBS溶液を交換します。ステージ37/38から、オタマジャクシ飼育水で満たされたタンクで胚を育て、ステージ45からステップ2.2.3に進みます。

4.細胞傷害性眼内 _CoCl2 注射による網膜細胞変性

注:このプロトコルはXenopusのlaevisのオタマジャクシの塩化コバルト(CoCl₂)の眼内注入によって網膜細胞の変性を引き起こすために確立される。用量に応じて、それは円錐特異的な変性またはより広範な変性を引き起こす可能性があります¹⁴。このプロトコルは、ステージ48以降のXenopus laevisオタマジャクシで使用しています。また、Xenopus tropicalisのオタマジャクシにも使用できます。

1. 緩衝液および試薬の調製
   1. ステップ1.1のように使用時に0.005%ベンゾカイン溶液を調製します。
   2. 118.5 mg を 5 mL の 0.1x MBS に添加して、100 mM CoCl₂ ストック溶液を調製します(0.1 x MBS の調製についてはステップ 3.1.4 を参照)。この原液を4°Cで数ヶ月間保存し、アルミホイルで光から保護します。
      注意:CoCl₂ は、人間および動物の生命にとって有毒な化合物として分類されています。安全データシートの取り扱い、保管、および廃棄物処理の指示に注意深く従ってください。
   3. 錐体特異的変性の場合は、0.1x MBSで希釈した100 mMストック溶液から、使用時に10 mM CoCl₂ 溶液を調製します。より広範な網膜細胞変性の場合は、25 mM CoCl₂ 溶液を調製します。
2. 注入システムの準備
   1. マイクロピペットプー ^ラー13でガラス毛細管を研ぎます。
   2. シャープにしたキャピラリーに2-10 μLの10または25 mM CoCl₂ 溶液またはコントロール溶液(0.1x MBS)をマイクロローダーチップで充填し、キャピラリーをマイクロインジェクターハンドラーに入れます。
   3. 実体顕微鏡の最高倍率で、微細な鉗子で毛細血管先端を切断し、注入時間(約100ms)を調整して、1パルスあたり15〜40nLの吐出量を得ます。突出圧力を ~40 PSI に設定します。
      注:ドロップのサイズは、オタマジャクシの段階と目の大きさに合わせる必要があります。例えば、ステージ48-49では、液滴サイズは~15-20 nLであるが、ステージ52-56では30-40 nLである。視覚的には、液滴のサイズはレンズのサイズよりも少し大きいです。
3. CoCl₂ 眼内注射
   1. 水槽内のオタマジャクシを捕まえるためにディップネットを使用してください。それらを50 mLの0.005%ベンゾカイン溶液に移します。.オタマジャクシが刺激に反応しなくなるまで数分待ちます。
      注:複数のオタマジャクシを同時に麻酔することができますが、麻酔薬に費やされる時間は30分未満である必要があります。
   2. スプーンを使って1匹のオタマジャクシを捕まえ、ウェットティッシュを入れた小さなシャーレ(直径55 mm)に慎重に入れます。オタマジャクシの背側をペトリ皿の中央に置きます(図1F、G)。
   3. 実体顕微鏡下でマイクロインジェクターを使用して、CoCl₂ 溶液を眼内に注入します。キャピラリーをレンズ越しに目にそっと挿入します。毛細血管の先端が目の内側にある場合は、片目あたり2滴を吐出します。右目を注射した後、ペトリ皿を手動で180°回転させて左目を注射します。
      注意: 注射は目の中で行われるようにしてください、それで、溶液を排出するたびに目のわずかな腫れを見る必要があります。オタマジャクシはできるだけ水の外にとどまる必要があります。両眼の注射は1分以内に完了します。
   4. 注入したオタマジャクシを1Lの飼育水が入った大きなタンクに移し、ペトリ皿に注意深く浸します(図1H)。オタマジャクシが完全に目覚めるまで監視します。

5.網膜損傷または網膜変性を評価するための染色

1. オタマジャクシの固定と脱水
   1. 100 mL の 32% PFA 溶液を 700 mL の 1x PBS に希釈して、4% パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製します。NaOHでpHを7.4に調整します。この原液を分注し、-20°Cで数ヶ月間保存します。
   2. オタマジャクシを0.01%ベンゾカインで安楽死させ、4%PFAを含むバイアルに移し、室温で2時間攪拌するか、4°Cで一晩移します。 1x PBSで5分×3をすすぎます。
   3. オタマジャクシを70%および95%エタノール(II型水で希釈)で連続して30分間インキュベーションし、その後100%エタノールでさらに3回1時間インキュベートして徐々に脱水します。オタマジャクシの頭部は、この工程で-20°Cで保存するか、100%ブタノールに直接一晩移して次の工程に移します。
2. パラフィンセクショニング
   1. 100%ブタノールを溶融パラフィンと交換し、62°Cで2時間。 パラフィンを交換して、62°Cで2 x 2時間追加インキュベーションします。
   2. オタマジャクシの頭を使い捨てのパラフィン埋め込み型に移し、目がよく揃うように向きを変えてから、パラフィンを固めます。ブロックは室温で保管してください。
   3. 余分なパラフィンを取り除き、ミクロトームサポートにオタマジャクシを埋め込んだブロックを取り付けます。
   4. ブロックを適切な厚さ(10〜12μm)のミクロトームで切片化します。3%グリセリンアルブミン(水で希釈)で事前に覆ったスライド上の切片でリボンを移します。
   5. スライドを42°Cのスライドウォーマーに置き、数分間、余分なグリセリンアルブミンを取り除きます。スライドを37°Cのオーブンで一晩乾燥させます。
   6. スライドを100%キシレンで満たされたCoplinジャーに2 x 15分間浸して脱ワックスします。100%を2回、70%、50%(タイプII水で希釈)、それぞれ~5分間、続いて2 x 5分間の水で切片を再水和します。
3. 免疫蛍光標識
   1. 29.4gのクエン酸ナトリウム三ナトリウム塩二水和物(C₆H₅Na₃O₇、2H₂O)を1 LのタイプII水に添加して、100 mMクエン酸ナトリウム(CiNa)ストック溶液を調製する。塩酸(HCl)でpHを6に調整します。オートクレーブ滅菌し、室温で数ヶ月間保管してください。使用時に、225 mLのタイプII水に25 mLの100 mM CiNaストック溶液を加えて、マスキング解除溶液を調製します。125 μL の Tween-20 を加え、よく混合します(最終濃度は 10 mM CiNa、0.05% Tween-20)。
   2. 100 mgのビスベンズイミドH 33258を10 mLのI型水に添加して、10 mg / mLのヘキストストック溶液を調製します。.この原液を4°Cで数ヶ月間保存し、アルミホイルで光から保護します。300 μL の Hoechst 原液を 400 mL の 1x PBS に加えて、7.5 μg/mL のヘキスト溶液を調製します。
      注:この溶液は最大10回使用でき、アルミニウムホイルで光から保護し、4°Cで約6か月間保存できます。
   3. 切片を脱ろうした後、切片をマスキング解除液中で9分間煮沸して抗原賦活化を行います。溶液を20分間冷まします。
   4. タイプII水で1回、1x PBSで1回すすぎます。スライドを湿潤チャンバーに平らに置き、スライドあたり400〜600 μLのブロッキング溶液(抗体希釈液 + 0.2% Triton X100)を30分間加えます。
   5. ブロッキング溶液を、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体のスライドあたり200 μLと交換します。カバーガラスを使用して溶液を切片に広げ、気泡の形成を防ぎます。湿度の高いチャンバーで4°Cで一晩インキュベートします。
   6. スライドをCoplinジャーに移し、0.1 % Triton X100を添加した1x PBSで10分×3回すすぎます。スライドを平らに置き、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体をスライドあたり400 μL添加し、湿度の高いチャンバー内で室温で2時間放置します。
   7. スライドを Coplin ジャーに移し、0.1% Triton X100 を添加した 1x PBS で 5 分 x 3 分間すすぎます。
   8. 細胞核をヘキスト溶液で10分間対比染色し、1x PBSで3 x 5分間すすぎます。
   9. カバーガラスをスライドの上に置き、蛍光を保持するように特別に設計された水性封入剤に入れます。スライドを室温で1時間乾燥させ、4°Cで保管します。
   10. スライドを蛍光顕微鏡で画像化します。
4. 網膜損傷を評価するためのヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色
   注:免疫染色によって特定の細胞タイプを標識する代わりに、一般的な網膜組織型をH&Eカラーで評価できます。
   1. 切片を脱ワックスした後、スライドをヘマトキシリン溶液に2分間浸漬して核酸標識を行います。水道水でよくすすいでください。
   2. スライドを1%エオシン溶液に1分間浸漬して細胞質標識を行います。水ですばやくすすいでください。
      注:エオシンは非常に溶けやすいです。スライドを水中に長時間放置すると、すべての染料が消えてしまいます。
   3. 100%エタノールで2 x 5分、キシレンで2 x 5分すすぎます。
   4. ボンネットの下に、封入剤を4〜5滴垂らしてスライドの上にカバーガラスを置きます。スライドをフードの下で乾かし、翌日顕微鏡で画像化します。
5. アポトーシス細胞の検出
   1. 切片を脱ろうした後(セクション5.2.6を参照)、キットメーカーのプロトコルに従ってアポトーシスDNA断片化を検出します。
   2. スライドをヘキスト溶液(セクション5.3.8を参照)に浸漬して核染色を行い、蛍光を保持するように特別に設計された水性封入剤でマウントします。スライドを室温で1時間乾燥させ、4°Cで保管します。
   3. スライドを蛍光顕微鏡で画像化します。

結果

機械的網膜損傷
プロトコルセクション1に記載されている機械的損傷を受けたオタマジャクシの網膜切片は、網膜病変が穿刺部位に限定されたまま、組織のすべての層を包含していることを示しています(図2A、B)。

NTR-MTZシステムを用いた条件付き桿体細胞アブレーション
プロトコルセクション2に記載され?...

ディスカッション

Xenopusオタマジャクシにおけるさまざまな網膜損傷パラダイムの長所と短所

機械的網膜損傷
Xenopusオタマジャクシでは、神経網膜のさまざまな外科的損傷が開発されています。神経網膜は、完全に切除されるか15,16か、部分的にのみ切除されるかのどちらかである^16,17。<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325