Xenopus Kurbağa Yavrularında Retina Yaralanma Modellerinin Oluşturulması

Özet

Xenopus laevis kurbağa yavrularında retina hasarını veya retina dejenerasyonunu indüklemek için çeşitli protokoller geliştirdik. Bu modeller retinal rejenerasyon mekanizmalarını inceleme imkanı sunar.

Özet

Retinal nörodejeneratif hastalıklar körlüğün önde gelen nedenleridir. Araştırılan çok sayıda terapötik strateji arasında, son zamanlarda kendi kendini onarmayı teşvik etmek özellikle çekici olarak ortaya çıktı. Retina onarımı için hücresel bir ilgi kaynağı, kök hücre potansiyelini ve anamniyotlarda olağanüstü bir rejeneratif kapasiteyi barındıran Müller glial hücresidir. Ancak bu potansiyel memelilerde çok sınırlıdır. Rejeneratif yeteneklere sahip hayvan modellerinde retinal rejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesi, memeli Müller hücrelerinin retinayı yenilemek için gizli yeteneğinin nasıl ortaya çıkarılacağına dair fikir vermelidir. Bu, rejeneratif tıpta terapötik stratejilerin geliştirilmesi için önemli bir adımdır. Bu amaçla, Xenopus'ta birkaç retina yaralanması paradigması geliştirdik: mekanik bir retina yaralanması, nitroredüktaz aracılı fotoreseptör koşullu ablasyonuna izin veren bir transgenik hat, CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtına dayalı bir retinitis pigmentosa modeli ve göz içi CoCl₂ enjeksiyonları tarafından yönlendirilen bir sitotoksik model. Avantajlarını ve dezavantajlarını vurgulayarak, burada çeşitli dejeneratif koşullar oluşturan ve Xenopus'ta retinal rejenerasyonun incelenmesine izin veren bu protokol serisini açıklıyoruz.

Giriş

Dünya çapında milyonlarca insan, retinitis pigmentosa, diyabetik retinopati veya yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi körlüğe yol açan çeşitli retinal dejeneratif hastalıklardan muzdariptir. Bugüne kadar, bu koşullar büyük ölçüde tedavi edilemez kalmaktadır. Değerlendirilmekte olan mevcut terapötik yaklaşımlar arasında gen terapisi, hücre veya doku nakilleri, nöroprotektif tedaviler, optogenetik ve protez cihazlar yer almaktadır. Ortaya çıkan bir başka strateji, kök hücre potansiyeline sahip endojen hücrelerin aktivasyonu yoluyla kendi kendini yenilemeye dayanmaktadır. Retinanın majör glial hücre tipi olan Müller glial hücreleri, bu bağlamda hücresel ilgi kaynakları arasındadır. Yaralanma üzerine, farklılaşabilir, çoğalabilir ve nöronlar ^{üretebilirler 1,2,3}. Bu işlem zebra balığı veya Xenopus'ta çok etkili olmasına rağmen, memelilerde büyük ölçüde verimsizdir.

Bununla birlikte, mitojenik proteinlerle veya çeşitli faktörlerin aşırı ekspresyonu ile uygun tedavilerin, memeli Müller glia hücre döngüsünün yeniden girişini indükleyebileceği ve bazı durumlarda müteakip nörojenez taahhüdünü ^{tetikleyebileceği gösterilmiştir} 1,2,3,4,5. Ancak bu, tedaviler için büyük ölçüde yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle, Müller kök benzeri hücre özelliklerini verimli bir şekilde yeni hücresel terapötik stratejilere dönüştürebilen molekülleri tanımlamak için rejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgimizi artırmak gereklidir.

Bu amaçla, Xenopus'ta retinal hücre dejenerasyonunu tetikleyen çeşitli yaralanma paradigmaları geliştirdik. Burada, (1) hücre tipine özgü olmayan mekanik bir retina hasarı, (2) çubuk hücrelerini hedef alan NTR-MTZ sistemini kullanan koşullu ve geri dönüşümlü bir hücre ablasyon modeli, (3) bir CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtı, ilerleyici çubuk hücre dejenerasyonunu tetikleyen bir retinitis pigmentosa modeli ve (4) bir CoCl₂-doza göre spesifik olarak konileri hedefleyebilen veya daha geniş retinal hücre dejenerasyonuna yol açabilen indüklenmiş sitotoksik model. Her paradigmanın özelliklerini, avantajlarını ve dezavantajlarını vurguluyoruz.

Protokol

Hayvan bakımı ve deneyleri, kurumsal yönergelere uygun olarak, kurumsal lisans A91272108 altında yürütülmüştür. Çalışma protokolleri, kurumsal hayvan bakım komitesi CEEA #59 tarafından onaylandı ve APAFIS #32589-2021072719047904 v4 ve APAFIS #21474-2019071210549691 v2 referans numarası altında Direction Départementale de la Protection des Populations tarafından yetkilendirildi. Bu protokollerde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Mekanik retina yaralanması

NOT: Burada açıklanan yaralanma paradigma protokolü, evre 45'ten itibaren bir kurbağa yavrusunun mekanik retinal delinmesinden oluşur. Bu nedenle, belirli bir retina hücre tipini hedeflemez, ancak delinme bölgesinde retinanın tüm kalınlığına zarar verir.

1. Kurbağa yavruları için anestezinin hazırlanması
   1. % 10'luk bir benzokain stok çözeltisi hazırlayın. Toplam 10 mL hacim için 1 g benzokain, 2 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ve 8 mL propilen glikol ekleyin. Stok çözeltisini alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak 4 °C'de birkaç ay muhafaza edin.
   2. 50 mL kurbağa yavrusu yetiştirme suyuna (filtrelenmiş ve klorsuz musluk suyu) 25 μL %10 benzokain stok çözeltisi ekleyerek kullanım sırasında% 0.005 benzokain çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın.
      NOT: Benzokain konsantrasyonu özellikle düşüktür çünkü kurbağa yavruları yetişkinlere kıyasla anesteziye karşı oldukça hassastır.
2. Pim hazırlama
   1. Sterilize edilmiş bir pim tutucuya 0.2 mm çapında steril bir pim takın (Şekil 1A).
3. Kurbağa yavrusu anestezisi
   1. Kurbağa yavrularını tanklarında yakalamak için bir daldırma ağı kullanın. Bunları% 0.005 benzokain çözeltisi içeren yeni bir tanka aktarın. Kurbağa yavruları uyaranlara tepki vermeyi bırakana kadar birkaç dakika bekleyin (tanka dokunmak veya doğrudan temas).
      NOT: Birkaç kurbağa yavrusu aynı anda uyuşturulabilir, ancak anestezik solüsyonda harcanan süre 30 dakikadan az olmalıdır.
4. Retina ponksiyonu
   1. Bir kurbağa yavrusunu yakalamak için bir kaşık kullanın ve ıslak bir doku içeren küçük bir Petri kabına (55 mm çapında) dikkatlice koyun. Kurbağa yavrusunun sırt tarafı yukarı bakacak şekilde Petri kabının ortasına yerleştirin.
   2. Stereomikroskop altında, retinadan geçene kadar gözün dorsal tarafındaki pimi nazikçe sokarak retinayı delin (Şekil 1A). Birkaç dürtme gerekiyorsa, bu işlemi farklı yerlerde tekrarlayın. Sağ gözü deldikten sonra, sol gözü delmek için Petri kabını 180° çevirin.
   3. Lezyonlu kurbağa yavrusunu, Petri kabını dikkatlice daldırarak 1 L yetiştirme suyu içeren büyük bir tanka aktarın. Kurbağa yavrularını tamamen uyanana kadar izleyin.

2. NTR-MTZ sistemini kullanarak koşullu çubuk hücre ablasyonu

Protokol, Fransız Xenopus kaynak merkezine ev sahipliği yapan TEFOR Paris-Saclay'in zooteknik servisinde bulunan Xenopus Tg(rho:GFP-NTR) transgenik hat^6'da spesifik çubuk hücre ablasyonunu indüklemeyi amaçlıyor. Bu kemogenetik sistem, NTR eksprese eden çubukları spesifik olarak ablate etmek için ön ilaç metronidazolünü (MTZ) sitotoksik bir DNA çapraz bağlama maddesine dönüştürmek için nitroredüktaz (NTR) enziminin kapasitesini kullanır (Şekil 1B). Tg(rho:GFP-NTR) veya Tg(rho:NTR) transgenik hayvanları yapmak ve dejenerasyonu indüklemek için iki ayrıntılı protokol daha önce yayınlanmıştır ^7,8. Burada, retina dejenerasyonunun indüksiyonunu ve dejenerasyon sürecinin in vivo olarak nasıl izleneceğini detaylandırıyoruz.

1. Metronidazol çözeltisinin hazırlanması
   1. Manyetik bir karıştırma çubuğu ve bir manyetik karıştırıcı kullanarak% 0,1 DMSO içeren 1 L kurbağa yavrusu yetiştirme suyunda 1,67 g MTZ tozunu koyu renkli bir şişede çözerek kullanım sırasında 10 mM MTZ çözeltisi hazırlayın.
      NOT: MTZ ışığa duyarlıdır. Tam çözünme 10 dakika kadar sürebilir.
2. Tg(rho:GFP-NTR) hattından doğal çiftleşme yoluyla transgenik kurbağa yavrularının üretilmesi
   NOT: Transgenik erkekler değerli bir stoğu temsil ettiğinden, erkeği feda etmemek ve tekrar tekrar kullanmak için doğal çiftleşme yoluyla embriyo üretmeyi tercih ediyoruz.
   1. Hormon uygulaması
      1. 600 IU insan koryonik gonadotropin hormonu (hCG) 25G iğnelerle Xenopus laevis vahşi tip dişilerin dorsal lenf kesesine enjekte edin. Transgenik erkeklere 100-200 IU hCG ile dorsal lenf kesesine enjekte edin. Çubuk dejenerasyonunun canlı izlenmesi için (adım 2.4), üretilen transgenik kurbağa yavrularının gözündeki floresan varyasyonlarını daha iyi görselleştirmek için pigmentli olanlar yerine albino Xenopus kullanın.
         NOT: Xenopus dişileri, planlanan yumurtlamadan 1 ila 7 gün önce 50 IU hCG ile hazırlanabilir, ancak bu isteğe bağlıdır.
   2. Çiftleşme ve yumurta toplama
      1. HCG enjeksiyonundan hemen sonra, ertesi güne kadar 20 ° C'de bir hCG enjekte edilmiş dişi ile birlikte bir Tg (rho: GFP-NTR) transgenik erkeği bir tanka koyun. Büyük bir hacim (en az 10 L) kullanın ve yumurtaların yapışması için küçük nesneler ekleyin, böylece yumurtalar yetişkinlerin hareketlerinden zarar görmez. Ertesi gün, kurbağalar artık amplexus'ta olmadığında, yetişkinleri tanktan çıkarın ve embriyoları toplayın.
   3. Embriyo ve kurbağa yavrularının yetiştirilmesi
      1. Embriyoları ve kurbağa yavrularını Xenopus gelişiminin normal tablosuna göre evreleyin⁹.
      2. Kurbağa yavrusu yetiştirme suyuyla dolu bir tankta embriyoları büyütün. 45. aşamadan itibaren, kurbağa yavrularını toz yavru yemi ile besleyin ve suyu bir fıskiye ile oksijenlendirin. Buharlaşmayı telafi etmek için gerekirse günlük su ekleyin ve tüm tank suyunu haftalık olarak değiştirin.
         NOT: Alternatif olarak, hacmin %50'sini haftada iki kez değiştirmek de mümkündür. Ayrıntılı bir protokol^10'da bulunabilir.
   4. Transgenik embriyo ayıklama
      1. Aşama 37/38'den itibaren, GFP'yi doğrudan görselleştirerek bir floresan stereomikroskop altında transgenik embriyoları sıralayın ve seçin (Şekil 1C).
3. Kurbağa yavrusu MTZ tedavisi
   1. Tg(rho:GFP-NTR) transgenik kurbağa yavrularını 10 mM MTZ solüsyonu içeren bir tanka aktarın ve 1 hafta boyunca karanlıkta 20 °C'de bekletin. Kontrol olarak% 0.1 DMSO içeren kurbağa yavrusu yetiştirme suyunda yetiştirilen transgenik kardeşleri kullanın.
   2. Tedavi süresi boyunca MTZ'yi ve kontrol solüsyonunu iki günde bir değiştirin. MTZ tedavisi sırasında kurbağa yavrularını her zamanki gibi besleyin.
   3. Bireysel floresan izleme için (adım 2.4), her bir kurbağa yavrusunu 30 mL MTZ veya adım 2.3.1'den itibaren kontrol solüsyonu içeren küçük kabına yerleştirin.
      NOT: MTZ tedavisi evre 45'ten itibaren herhangi bir zamanda yapılabilir.
4. Çubuk dejenerasyonunun canlı izlenmesi
   NOT: Çubukların aşamalı dejenerasyonu gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bu nedenle, 2.4.1 adımlarını gerçekleştirin. 2.4.4'e kadar. MTZ tedavisinden önce ve daha sonra tedaviden sonra düzenli olarak.
   1. Anestezik ve kurbağa yavrusu anestezisinin hazırlanması için sırasıyla 1.1 ve 1.3 adımlarını izleyin.
   2. Bir kurbağa yavrusunu yakalamak için bir kaşık kullanın ve küçük bir Petri kabında (55 mm çapında) ıslak bir mendil üzerine dikkatlice koyun. GFP floresansını bir floresan stereomikroskop altında gözlemleyin (uyarma dalga boyu = 488 nm ve emisyon dalga boyu = 509 nm) ve gözün fotoğraflarını çekin. Azalan floresan yoğunluğu, çubukların bozulmasını yansıtır.
      NOT: Kantitatif karşılaştırmalar yapmak için, tüm kurbağa yavrularını görüntülemek için aynı ayarlar korunmalıdır.
   3. Görüntülenen kurbağa yavrusunu, Petri kabını dikkatlice daldırarak 1 L yetiştirme suyu içeren büyük bir tanka aktarın. Kurbağa yavrularını tamamen uyanana kadar izleyin.
   4. Dejenerasyon sürecinin etkinliğini izlemek ve değerlendirmek için MTZ ile tedavi edilen ve kontrol kurbağa yavrusu gözleri arasındaki floresan yoğunluğunu karşılaştırın.

3. CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavt ile çubuk hücre dejenerasyonu

NOT: Bu protokol, CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavtı kullanılarak spesifik çubuk hücre dejenerasyonunu indükleyerek Xenopus laevis'te bir retinitis pigmentosa modeli oluşturmak için oluşturulmuştur. F0'daki ekleme-silme (indels) yüzdesi^11'de sağlanır ve ~%75'tir. Böyle bir CRISPR/Cas9 aracılı rodopsin nakavt, Xenopus tropicalis kurbağa yavrularında da gerçekleştirilebilir ¹¹.

1. Çözeltilerin ve reaktiflerin hazırlanması
   1. crRNA ve tracrRNA sıralaması
      1. Rodopsin (rho) genini ve standart trans-aktive edici crRNA'yı (tracrRNA) hedefleyen sentetik CRISPR RNA'yı (crRNA) satın alın. crRNA, rho hedefine özgü bir bölgeden (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) ve tracrRNA'ya hibritleşen başka bir bölgeden (GUUUUAGAGCUAUGCU) oluşur.
   2. crRNA:tracrRNA dubleks (rho gRNA dubleks)
      1. Nükleaz içermeyen dubleks tamponda crRNA ve tracrRNA'yı 100 μM'de yeniden süspanse edin.
      2. 3 μL 100 μM rho crRNA, 3 μL 100 μM tracrRNA ve 94 μL dubleks tamponu karıştırarak gRNA dupleksini hazırlayın. Nihai konsantrasyonlar 36 ng/μL rho crRNA ve 67 ng/μL tracrRNA'dır.
      3. Oligoları 95 °C'de 5 dakika ısıtarak tavlayın ve yavaşça oda sıcaklığına soğutun. Alikotlar yapın ve -20 °C'de saklayın.
   3. CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi (yani, gRNA dupleks/Cas9 proteini)
      1. Kullanım sırasında, rho gRNA dubleks ve Cas9 proteini karışımını hazırlayın. 20 μL için 10 μL rho gRNA dupleks çözeltisi, 2 μL Cas9 proteini (5 mg/mL'de stok), 2 μL floresein lizin dekstran (10 mg/mL'de stok) ve 6 μL RNaz içermeyen su ekleyin.
      2. Ribonükleoprotein kompleksini oluşturmak için 37 °C'de 10 dakika inkübe edin ve çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
      3. 20 μL kontrol çözeltisi için 2 μL Cas9 proteini, 2 μL floresein lizin dekstran ve 16 μL RNaz içermeyen su karıştırın.
   4. 10x, 1x ve 0.1x MBS çözümlerinin hazırlanması
      1. 11.92 g HEPES, 51.43 g sodyum klorür (NaCl), 0.75 g potasyum klorür (KCl), 2.1 g sodyum bikarbonat (NaHCO3) ve 2.46 g magnezyum sülfat heptahidrat (_MgS4, _7H2O) ekleyerek Modifiye Barth'ın Tuzlu su stok çözeltisini (10x MBS) hazırlayın 800 mL tip II suda. %30 sodyum hidroksit (NaOH) ile pH'ı 7,8'e ayarlayın. Hacim 1 L olana kadar tip II su ekleyin ve otoklavlayarak sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın.
      2. Tip II suda 100 mL 10x MBS tuz çözeltisi ve 7 mL 0.1 M kalsiyum klorür dihidrat (CaCl 2, 2H₂ O) seyrelterek 1 L 1x MBS çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
      3. 1x MBS çözeltisini tip II suda seyrelterek 0.1x MBS çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
   5. Yetişkinler için benzokain çözeltisi
      1. 1 L kurbağa yavrusu yetiştirme suyuna 5 mL %10 benzokain stok çözeltisi (bkz. adım 1.1.1.) ekleyerek %0,05 benzokain çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın.
         NOT: Bu çözeltiyi alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak 4 °C'de birkaç ay saklayın. Çözeltiyi hayvanlarda kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.
   6. L-sistein çözeltisi
      1. 100 mL 0.1x MBS çözeltisine 2 g L-sistein hidroklorik monohidrat ekleyerek kullanım sırasında jelleştirme çözeltisini hazırlayın. PH'ı %30 NaOH ile 7,8'e ayarlayın.
   7. Polisükroz çözeltisi
      1. 100 mL 0.1x MBS çözeltisine 3 g polisakaroz ekleyerek yoğun polisakaroz çözeltisini hazırlayın. Bu solüsyonu 4 °C'de birkaç hafta saklayın.
2. İn vitro fertilizasyon ve jelitasyon
   NOT: Xenopus in vitro fertilizasyon hakkında daha fazla ayrıntı,^12'deki ayrıntılı özel bir protokolde bulunabilir.
   1. Yumurtlamayı indüklemek için Xenopus laevis dişilerine hormon uygulaması
      1. Oosit alımından yaklaşık 15 saat önce, dişinin dorsal lenf kesesine 600 IU hCG enjekte edin ve gece boyunca 18 ° C'de tutun.
   2. Testis diseksiyonu
      1. Xenopus erkeğini 10-15 dakika boyunca öldürücü dozda% 0.05 benzokain çözeltisi ile ötenazi yapın. Tamamlayıcı bir ötenazi yöntemi olarak, keskin ve sağlam bir makasla kafatasının hemen arkasındaki omurgayı kesin. Karın boşluğunu diseksiyon makasıyla açın, testisleri kesin ve bağlı yağ ve kılcal damarları kesin. Her testisi hemen 1 mL 1x MBS'de buza yerleştirin.
   3. Sperm hazırlama
      1. Mikrosantrifüj tüpleri için bir havaneli kullanarak bir testisi ezin ve süspansiyonu 9 mL 1x MBS içeren 15 mL'lik bir tüpte seyreltin. İkinci testis tüpüne 10 μg/mL gentamisin ekleyin ve daha sonraki döllenme deneyleri için birkaç gün 4 °C'de tutun.
   4. Tüp bebek tedavisi
      1. Hormon enjekte edilen dişinin sırtına hafifçe masaj yapın ve oositleri bir Petri kabında (100 mm çapında) toplayın. Yumurta çözeltisine birkaç damla sperm çözeltisi sürün. 5 dakika bekleyin ve 0.1x MBS ile örtün. Jelalize işlemine devam etmeden önce 10 dakika bekleyin.
   5. Döllenmiş yumurta dejelasyonu
      1. Döllenmiş yumurtalardan jöle tabakasını çıkarmak için 0.1x MBS solüsyonunu jöle giderme solüsyonu ile değiştirin (~5 dk). Embriyoları 0.1x MBS ile 5-6 kez iyice durulayın ve 0.1x MBS ile doldurulmuş 100 mm'lik yeni bir Petri kabına aktarın.
3. Mikroenjeksiyon sisteminin hazırlanması
   1. Cam kılcal damarları mikropipet çektirmesiyle keskinleştirin¹³.
   2. Keskinleştirilmiş bir kılcal damarı 2-10 μL CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi veya bir mikro yükleyici ucu kullanarak kontrol solüsyonu ile doldurun ve kılcal damarı mikroenjektör işleyicisine yerleştirin.
   3. Bir stereomikroskobun en yüksek büyütme oranında, kılcal ucu ince forseps ile kırın ve darbe başına 10 nL'lik bir ejeksiyon hacmi elde etmek için enjeksiyon süresini (~ 400 ms) ayarlayın. Ejeksiyon basıncını yaklaşık 40 PSI'ye ayarlayın.
4. CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi ile tek hücreli aşamalı embriyo mikroenjeksiyonu
   1. Tek hücreli aşamalı embriyoları,% 3 polisakaroz çözeltisi ile doldurulmuş 100 mm'lik bir Petri kabına yapıştırılmış bir ızgaraya (1 mm naylon doku) yerleştirin (Şekil 1D).
   2. Mikroenjektörü kullanarak ve bir stereomikroskop altında, 10 nL CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi (embriyo başına 500 pg gRNA dubleks + 5 ng Cas9 proteinine karşılık gelir) veya kontrol solüsyonunu hayvan kutbu seviyesinde, kortikal bölgede, sitoplazmik membranın hemen altında enjekte edin.
      NOT: Çözeltide bulunan floresein lizin dekstran, enjekte edilen embriyoların daha sonra sıralanmasına izin verir.
   3. Enjekte edilen embriyoları temiz bir poliskaroz çözeltisi içeren 100 mm'lik yeni bir Petri kabına aktarın ve 21 °C'ye yerleştirin.
   4. İlk gün, iyi gelişmiş embriyoları düzenli olarak ayırın ve polisakaroz çözeltisini mikroenjeksiyondan yaklaşık 5 saat sonra 0.1x MBS ile değiştirin.
   5. Enjeksiyondan sonra, floresan stereomikroskop altında floresein lizin dekstranı görselleştirerek iyi enjekte edilmiş rho gevrek embriyoları sıralamak ve seçmek için 24 saat bekleyin (Şekil 1E).
      NOT: Döllenmeden sonra mikroenjeksiyon ne kadar erken olursa, nakavt o kadar etkili olur.
5. Embriyo ve kurbağa yavrularının yetiştirilmesi
   1. Evre 37/38'e kadar Petri kaplarında 0.1x MBS'de rho gevrek embriyoları yükseltin. Ölü embriyoları günlük olarak çıkarın ve 0.1x MBS solüsyonunu değiştirin. Aşama 37/38'den itibaren, kurbağa yavrusu yetiştirme suyuyla dolu bir tankta embriyoları büyütün ve aşama 45'ten itibaren adım 2.2.3'teki gibi devam edin.

4. Sitotoksik göz içi CoCl ₂ enjeksiyonları ile retina hücre dejenerasyonu

NOT: Bu protokol, Xenopus laevis kurbağa yavrularında göz içi kobalt klorür (CoCl₂) enjeksiyonları ile retina hücre dejenerasyonunu indüklemek için oluşturulmuştur. Doza göre, koniye özgü bir dejenerasyonu veya daha geniş bir dejenerasyonu tetikleyebilir¹⁴. Bu protokolü 48. aşamadan itibaren yaşlanan Xenopus laevis kurbağa yavrularında kullanıyoruz. Xenopus tropicalis kurbağa yavrularında da kullanılabilir.

1. Tampon ve reaktiflerin hazırlanması
   1. Adım 1.1'de olduğu gibi kullanım sırasında% 0.005 benzokain çözeltisi hazırlayın.
   2. 100 mL ila 5 mL 0.1x MBS ekleyerek 2 mM CoCl₂ stok çözeltisi hazırlayın (0.1x MBS hazırlamak için adım 3.1.4'e bakın). Bu stok çözeltisini 4 °C'de birkaç ay boyunca alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak muhafaza edin.
      DİKKAT: CoCl₂ , insan ve hayvan yaşamı için toksik bir bileşik olarak sınıflandırılır. Güvenlik bilgi formundaki taşıma, depolama ve atık bertarafı talimatlarını dikkatlice izleyin.
   3. Koniye özgü dejenerasyon için, 0.1x MBS'de seyreltilmiş 100 mM stok çözeltisinden kullanım sırasında 10 mM CoCl₂ çözeltisi hazırlayın. Daha geniş retinal hücre dejenerasyonu için 25 mM CoCl₂ çözeltisi hazırlayın.
2. Enjeksiyon sisteminin hazırlanması
   1. Cam kılcal damarları mikropipet çektirmesiyle keskinleştirin ¹³.
   2. Bir mikro yükleyici ucu kullanarak keskinleştirilmiş bir kılcal damarı 2-10 μL 10 veya 25 mM CoCl₂ çözeltisi veya kontrol çözeltisi (0.1x MBS) ile doldurun ve kılcal damarı mikroenjektör işleyicisine yerleştirin.
   3. Bir stereomikroskobun en yüksek büyütme oranında, kılcal ucu ince forseps ile kırın ve darbe başına 15-40 nL'lik bir ejeksiyon hacmi elde etmek için enjeksiyon süresini (yaklaşık 100 ms) ayarlayın. Ejeksiyon basıncını ~40 PSI olarak ayarlayın.
      NOT: Damlanın boyutu, kurbağa yavrularının evresine ve gözlerinin boyutuna göre uyarlanmalıdır. Örneğin, 48-49. aşamalarda damla boyutu ~15-20 nL iken, 52-56. aşamalarda 30-40 nL'dir. Görsel olarak, damlanın boyutu lens boyutundan biraz daha büyüktür.
3. CoCl₂ göz içi enjeksiyonları
   1. Kurbağa yavrularını tanklarında yakalamak için bir daldırma ağı kullanın. Bunları 50 mL% 0.005 benzokain çözeltisine aktarın. Kurbağa yavruları uyaranlara tepki vermeyi bırakana kadar birkaç dakika bekleyin.
      NOT: Birkaç kurbağa yavrusu aynı anda uyuşturulabilir, ancak anestezide geçirilen süre 30 dakikadan az olmalıdır.
   2. Bir kurbağa yavrusunu yakalamak için bir kaşık kullanın ve ıslak bir doku içeren küçük bir Petri kabına (55 mm çapında) dikkatlice koyun. Kurbağa yavrusunun sırt tarafı yukarı bakacak şekilde Petri kabının ortasına yerleştirin (Şekil 1F,G).
   3. CoCl₂ solüsyonunu göz içine enjekte etmek için mikroenjektörü stereomikroskop altında kullanın. Kılcal damarı nazikçe lensin üzerinden göze sokun. Kılcal uç gözün içindeyken, göz başına iki damla dökün. Sağ gözü enjekte ettikten sonra, sol gözü enjekte etmek için Petri kabını manuel olarak 180° çevirin.
      NOT: Enjeksiyonun gözün içinde yapıldığından emin olun, bu nedenle solüsyonun her çıkarılmasından sonra gözde hafif bir şişlik görülmelidir. Kurbağa yavrusu mümkün olduğunca az suyun dışında kalmalıdır. Her iki gözün enjeksiyonu 1 dakikadan az sürmelidir.
   4. Enjekte edilen kurbağa yavrusunu, Petri kabına dikkatlice daldırarak 1 L yetiştirme suyu içeren büyük bir tanka aktarın (Şekil 1H). Kurbağa yavrularını tamamen uyanana kadar izleyin.

5. Retina hasarını veya retina dejenerasyonunu değerlendirmek için boyama

1. Kurbağa yavrusu fiksasyonu ve dehidrasyon
   1. 100 mL %32 PFA çözeltisini 700 mL 1x PBS'ye seyrelterek %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın. NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın. Bu stok çözeltisini ayırın ve -20 °C'de birkaç ay saklayın.
   2. Kurbağa yavrularını %0.01 benzokain içinde ötenazi yapın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalkalama ile veya gece boyunca 4 °C'de %4 PFA içeren bir şişeye aktarın. 1x PBS'de 3 x 5 dakika durulayın.
   3. Kurbağa yavrularını %70 ve %95 etanol (tip II suda seyreltilmiş) içinde art arda 30 dakikalık inkübasyonlarla aşamalı olarak dehidre edin, ardından %100 etanol içinde üç adet 1 saatlik inkübasyon daha yapın. Kurbağa yavrusu kafalarını bu adımda -20 °C'de saklayın veya sonraki adımlar için gece boyunca doğrudan% 100 bütanol'e aktarın.
2. Parafin kesit alma
   1. % 100 bütanol'ü 62 ° C'de 2 saat eritilmiş parafin ile değiştirin. Parafini 62 ° C'de 2 x 2 saat ek inkübasyonla değiştirin.
   2. Kurbağa yavrusu kafalarını tek kullanımlık parafin gömme kalıplarına aktarın ve gözleri iyi hizalanacak şekilde yönlendirin ve ardından parafinin sertleşmesine izin verin. Blokları oda sıcaklığında saklayın.
   3. Fazla parafini kesin ve bloğu gömülü kurbağa yavru(lar)ı ile mikrotom desteğine monte edin.
   4. Bloğu uygun kalınlıkta (10-12 μm) bir mikrotom ile bölümlere ayırın. Şeritleri, daha önce% 3 gliserin albümini (suyla seyreltilmiş) ile kaplanmış bir slayt üzerinde bölümlerle aktarın.
   5. Slaytı birkaç dakika boyunca 42 °C'de bir slayt ısıtıcısına yerleştirin ve ardından fazla gliserin albüminini çıkarın. Slaytları gece boyunca 37 °C'lik bir fırında kurumaya bırakın.
   6. Slaytları %100 ksilen ile doldurulmuş bir Coplin kavanozuna 2 x 15 dakika daldırarak mumdan arındırın. Bölümleri kademeli etanol serisi ile yeniden sulandırın:% 100 iki kez,% 70,% 50 (tip II suda seyreltilmiş), her biri ~ 5 dakika, ardından 2 x 5 dakika suda.
3. İmmünofloresan etiketleme
   1. 1 L Tip II suya 29.4 g sodyum sitrat trisodyum tuzu dihidrat (C6H5Na3O7,2H2O) ekleyerek 100 mMsodyum sitrat (CiNa) stok çözeltisi hazırlayın; Hidroklorik asit (HCl) ile pH'ı 6'ya ayarlayın. Otoklavlama ile sterilize edin ve birkaç ay oda sıcaklığında saklayın. Kullanım sırasında 225 mL tip II suya 25 mL 100 mM CiNa stok çözeltisi ekleyerek maskeleme solüsyonunu hazırlayın. 125 μL Tween-20 ekleyin ve iyice karıştırın (nihai konsantrasyon 10 mM CiNa,% 0.05 Tween-20'dir).
   2. 10 mL tip I suya 100 mg bisBenzimide H 33258 ekleyerek 10 mg / mL'de Hoechst stok çözeltisini hazırlayın. Bu stok çözeltisini 4 °C'de birkaç ay boyunca alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak muhafaza edin. 400 mL 1x PBS'ye 300 μL Hoechst stok çözeltisi ekleyerek 7.5 μg / mL'de Hoechst çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Bu çözelti 10 defaya kadar kullanılabilir ve alüminyum folyo ile ışıktan korunarak 4 °C'de yaklaşık 6 ay muhafaza edilebilir.
   3. Bölümleri mumdan arındırdıktan sonra, bölümleri maskeleme solüsyonunda 9 dakika kaynatarak antijen alımını gerçekleştirin. Çözeltiyi 20 dakika soğumaya bırakın.
   4. Tip II suda bir kez ve 1x PBS'de bir kez durulayın. Slaytları nemli bir odaya düz bir şekilde koyun ve 30 dakika boyunca slayt başına 400-600 μL bloke edici solüsyon (antikor seyreltici +% 0.2 Triton X100) ekleyin.
   5. Blokaj solüsyonunu, bloke edici solüsyon içinde seyreltilmiş primer antikorun slayt başına 200 μL ile değiştirin. Çözeltiyi bölümlere yaymak için kabarcık oluşumunu önleyerek bir lamel kullanın. Gece boyunca 4 °C'de nemli bir odada inkübe edin.
   6. Slaytları bir Coplin kavanozuna aktarın ve %0,1 Triton X100 ile desteklenmiş 1x PBS'de 3 x 10 dakika durulayın. Slaytları düz bir şekilde yerleştirin, blokaj çözeltisi içinde seyreltilmiş ikincil antikorun slayt başına 400 μL ekleyin ve nemli bir odada oda sıcaklığında 2 saat bekletin.
   7. Slaytları bir Coplin kavanozuna aktarın ve %0,1 Triton X100 ile desteklenmiş 1x PBS ile 3 x 5 dakika durulayın.
   8. Hücre çekirdeklerini Hoechst solüsyonu ile 10 dakika boyunca lekeleyin ve 1x PBS ile 3 x 5 dakika durulayın.
   9. Lamelleri, floresansı korumak için özel olarak tasarlanmış sulu bir montaj ortamında slaytların üzerine yerleştirin. Slaytları oda sıcaklığında 1 saat kurumaya bırakın ve 4 °C'de saklayın.
   10. Slaytları bir floresan mikroskobu ile görüntüleyin.
4. Retina hasarını değerlendirmek için hematoksilen ve eozin (H&E) boyama
   NOT: Belirli bir hücre tipini immün boyama ile etiketlemek yerine, genel retinal histoloji H & E renklendirmesi ile değerlendirilebilir.
   1. Bölümleri mumdan arındırdıktan sonra, slaytları 2 dakika boyunca hematoksilen çözeltisine batırarak nükleik asit etiketlemesi yapın. Musluk suyuyla iyice durulayın.
   2. Slaytları 1 dakika boyunca% 1 eozin çözeltisine batırarak sitoplazma etiketlemesi yapın. Su ile hızlıca durulayın.
      NOT: Eozin çok çözünür; Slaytlar suda çok uzun süre bırakılırsa, tüm boya kaybolur.
   3. % 100 etanolde 2 x 5 dakika ve ksilen içinde 2 x 5 dakika durulayın.
   4. Kaputun altına, lamellerin üzerine 4-5 damla montaj ortamı yerleştirin. Slaytları bir kaputun altında kurumaya bırakın ve ertesi gün mikroskopla görüntüleyin.
5. Apoptotik hücrelerin tespiti
   1. Bölümleri mumdan arındırdıktan sonra (bkz. bölüm 5.2.6), apoptotik DNA parçalanmasını tespit etmek için kit üreticisinin protokolünü izleyin.
   2. Slaytları Hoechst çözeltisine daldırarak çekirdek boyama gerçekleştirin (bkz. bölüm 5.3.8) ve floresansı korumak için özel olarak tasarlanmış sulu bir montaj ortamı ile monte edin. Slaytları oda sıcaklığında 1 saat kurumaya bırakın ve 4 °C'de saklayın.
   3. Slaytları bir floresan mikroskobu ile görüntüleyin.

Sonuçlar

Mekanik retina yaralanması
Protokol bölüm 1'de tarif edilen mekanik yaralanmaya maruz kalan kurbağa yavrularının retina kesitleri, retina lezyonunun ponksiyon bölgesi ile sınırlı kalırken dokunun tüm katmanlarını kapsadığını göstermektedir (Şekil 2A,B).

NTR-MTZ sistemi kullanılarak koşullu çubuk hücresi ablasyonu
Protokol bölüm 2'de tarif edildiği gibi MTZ tedavisi ile tedavi edile...

Tartışmalar

Xenopus kurbağa yavrularında çeşitli retina yaralanması paradigmalarının avantajları ve dezavantajları

Mekanik retina yaralanması
Xenopus kurbağa yavrularında nöral retinanın çeşitli cerrahi yaralanmaları gelişmiştir. Nöral retina ya tamamen^{çıkarılabilir 15,16} ya da sadece kısmen çıkarılabilir^16,17.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325