Создание моделей повреждений сетчатки у головастиков Xenopus

Резюме

Мы разработали несколько протоколов для индуцирования повреждения или дегенерации сетчатки у головастиков Xenopus laevis . Эти модели дают возможность изучать механизмы регенерации сетчатки.

Аннотация

Нейродегенеративные заболевания сетчатки являются основными причинами слепоты. Среди многочисленных терапевтических стратегий, которые изучаются, стимулирующее самовосстановление в последнее время стало особенно привлекательным. Клеточным источником, представляющим интерес для восстановления сетчатки, является глиальная клетка Мюллера, которая обладает потенциалом стволовых клеток и необычайной регенеративной способностью у анамнетов. Однако у млекопитающих этот потенциал очень ограничен. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации сетчатки на животных моделях с регенеративными способностями, должно дать представление о том, как разблокировать скрытую способность клеток Мюллера млекопитающих регенерировать сетчатку. Это ключевой шаг для разработки терапевтических стратегий в регенеративной медицине. С этой целью мы разработали несколько парадигм повреждения сетчатки в Xenopus: механическое повреждение сетчатки, трансгенная линия, позволяющая проводить условную абляцию фоторецепторов, опосредованную нитроредуктазой, модель пигментного ретинита, основанная на нокауте родопсина , опосредованного CRISPR/Cas9, и цитотоксическая модель, управляемая внутриглазными инъекциями CoCl₂ . Выделяя их преимущества и недостатки, мы описываем здесь эту серию протоколов, которые порождают различные дегенеративные состояния и позволяют изучать регенерацию сетчатки у Xenopus.

Введение

Миллионы людей во всем мире страдают от различных дегенеративных заболеваний сетчатки, приводящих к слепоте, таких как пигментный ретинит, диабетическая ретинопатия или возрастная макулярная дегенерация (ВМД). На сегодняшний день эти состояния остаются в значительной степени неизлечимыми. В настоящее время оцениваются терапевтические подходы, включающие генную терапию, трансплантацию клеток или тканей, нейропротекторное лечение, оптогенетику и протезы. Другая новая стратегия основана на саморегенерации путем активации эндогенных клеток с потенциалом стволовых клеток. Глиальные клетки Мюллера, основной тип глиальных клеток сетчатки, являются одним из клеточных источник....

протокол

Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами, в соответствии с институциональной лицензией A91272108. Протоколы исследования были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными CEEA #59 и получили разрешение от Direction Départementale de la Protection des Populations под номером APAFIS #32589-2021072719047904 v4 и APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этих протоколах, см. в Таблице материалов .

1. Механическая травма сетчатки

ПРИМЕЧА....

Результаты

Механическая травма сетчатки
Срезы сетчатки головастиков, подвергшиеся механической травме, описанной в разделе 1 протокола, показывают, что поражение сетчатки охватывает все слои ткани, оставаясь ограниченным местом прокола (рис. 2А,Б).

Обсуждение

Преимущества и недостатки различных парадигм повреждения сетчатки у головастиков Xenopus

Механическая травма сетчатки
У головастиков Xenopus развились различные хирургические повреждения нервной сетчатки. Нервная сетчатка может быть удалена л?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325