JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы разработали несколько протоколов для индуцирования повреждения или дегенерации сетчатки у головастиков Xenopus laevis . Эти модели дают возможность изучать механизмы регенерации сетчатки.

Аннотация

Нейродегенеративные заболевания сетчатки являются основными причинами слепоты. Среди многочисленных терапевтических стратегий, которые изучаются, стимулирующее самовосстановление в последнее время стало особенно привлекательным. Клеточным источником, представляющим интерес для восстановления сетчатки, является глиальная клетка Мюллера, которая обладает потенциалом стволовых клеток и необычайной регенеративной способностью у анамнетов. Однако у млекопитающих этот потенциал очень ограничен. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации сетчатки на животных моделях с регенеративными способностями, должно дать представление о том, как разблокировать скрытую способность клеток Мюллера млекопитающих регенерировать сетчатку. Это ключевой шаг для разработки терапевтических стратегий в регенеративной медицине. С этой целью мы разработали несколько парадигм повреждения сетчатки в Xenopus: механическое повреждение сетчатки, трансгенная линия, позволяющая проводить условную абляцию фоторецепторов, опосредованную нитроредуктазой, модель пигментного ретинита, основанная на нокауте родопсина , опосредованного CRISPR/Cas9, и цитотоксическая модель, управляемая внутриглазными инъекциями CoCl2 . Выделяя их преимущества и недостатки, мы описываем здесь эту серию протоколов, которые порождают различные дегенеративные состояния и позволяют изучать регенерацию сетчатки у Xenopus.

Введение

Миллионы людей во всем мире страдают от различных дегенеративных заболеваний сетчатки, приводящих к слепоте, таких как пигментный ретинит, диабетическая ретинопатия или возрастная макулярная дегенерация (ВМД). На сегодняшний день эти состояния остаются в значительной степени неизлечимыми. В настоящее время оцениваются терапевтические подходы, включающие генную терапию, трансплантацию клеток или тканей, нейропротекторное лечение, оптогенетику и протезы. Другая новая стратегия основана на саморегенерации путем активации эндогенных клеток с потенциалом стволовых клеток. Глиальные клетки Мюллера, основной тип глиальных клеток сетчатки, являются одним из клеточных источников, представляющих интерес в этом контексте. При травме они могут дедифференцироваться, размножаться и генерировать нейроны 1,2,3. Хотя этот процесс очень эффективен у рыбок данио или ксенопусов, он в значительной степени неэффективен у млекопитающих.

Тем не менее, было показано, что соответствующее лечение митогенными белками или гиперэкспрессией различных факторов может индуцировать повторный вход в клеточный цикл глии Мюллера у млекопитающих и, в некоторых случаях, вызвать их последующее участие в нейрогенезе 1,2,3,4,5. Тем не менее, этого остается в значительной степени недостаточно для лечения. Следовательно, расширение наших знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе регенерации, необходимо для выявления молекул, способных эффективно превращать свойства стволовых клеток Мюллера в новые клеточные терапевтические стратегии.

С этой целью мы разработали несколько парадигм повреждений у Xenopus , которые запускают дегенерацию клеток сетчатки. Здесь мы представляем (1) механическое повреждение сетчатки, которое не является специфичным для типа клетки, (2) условную и обратимую модель абляции клеток с использованием системы NTR-MTZ, которая нацелена на палочковые клетки, (3) CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут родопсина , модель пигментного ретинита, которая вызывает прогрессирующую дегенерацию палочек клеток, и (4) CoCl2-индуцированная цитотоксическая модель, которая в зависимости от дозы может специфически воздействовать на колбочки или приводить к более широкой дегенерации клеток сетчатки. Выделены особенности, преимущества и недостатки каждой парадигмы.

протокол

Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами, в соответствии с институциональной лицензией A91272108. Протоколы исследования были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными CEEA #59 и получили разрешение от Direction Départementale de la Protection des Populations под номером APAFIS #32589-2021072719047904 v4 и APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этих протоколах, см. в Таблице материалов .

1. Механическая травма сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный здесь протокол травмы состоит из механического пункции сетчатки головастика начиная с 45 стадии. Таким образом, он не нацелен на какой-либо конкретный тип клеток сетчатки, а повреждает всю толщину сетчатки в месте прокола.

  1. Приготовление анестетика для головастиков
    1. Приготовьте 10% бульонный раствор бензокаина. Для общего объема 10 мл добавьте 1 г бензокаина, 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и 8 мл пропиленгликоля. Исходный раствор хранить в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C, защищенный от света алюминиевой фольгой.
    2. Приготовьте 0,005% раствор бензокаина во время использования, добавив 25 мкл 10% исходного раствора бензокаина к 50 мл воды для выращивания головастиков (фильтрованной и дехлорированной водопроводной воды). Хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация бензокаина особенно низкая, потому что головастики более чувствительны к анестезии по сравнению со взрослыми.
  2. Подготовка штифтов
    1. Прикрепите стерильный штифт диаметром 0,2 мм к стерилизованному держателю штифта (Рисунок 1A).
  3. Анестезия головастика
    1. Используйте сачок, чтобы поймать головастиков в их аквариумах. Переложите их в новую емкость, содержащую 0,005% раствор бензокаина. Подождите несколько минут, пока головастики не перестанут реагировать на раздражители (постукивание по аквариуму или прямой контакт).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько головастиков могут быть обезболены одновременно, но время, проведенное в растворе анестетика, должно быть менее 30 минут.
  4. Пункция сетчатки
    1. С помощью ложки поймайте одного головастика и осторожно положите его на небольшую чашку Петри (диаметр 55 мм), содержащую влажную салфетку. Расположите головастика дорсальной стороной вверх в середине чашки Петри.
    2. Под стереомикроскопом проколите сетчатку, осторожно вводя штифт на тыльной стороне глаза, пока он не пройдет через сетчатку (рис. 1А). Если нужно несколько тычков, повторите эту процедуру в разных местах. После прокола правого глаза поверните чашку Петри на 180°, чтобы проколоть левый глаз.
    3. Перенесите пораженного головастика в большой резервуар, содержащий 1 л воды для выращивания, осторожно погрузив чашку Петри. Следите за головастиками до тех пор, пока они полностью не проснутся.

2. Условная абляция стержневых клеток с помощью системы НТР-МТЗ

Протокол направлен на индукцию специфической абляции палочек в трансгенной линии Xenopus Tg(rho:GFP-NTR) 6, доступной в зоотехнической службе TEFOR Paris-Saclay, где находится французский ресурсный центр Xenopus. Эта хемогенетическая система использует способность фермента нитроредуктазы (NTR) превращать пролекарство метронидазол (MTZ) в цитотоксический сшивающий агент ДНК для специфической абляции NTR-экспрессирующих палочек (рис. 1B). Два подробных протокола по превращению Tg(rho:GFP-NTR) или Tg(rho:NTR) в трансгенные животные и индуцированию дегенерации были опубликованы ранее 7,8. Здесь мы просто подробно опишем индукцию дегенерации сетчатки и то, как контролировать процесс дегенерации in vivo.

  1. Приготовление раствора метронидазола
    1. Приготовьте 10 мМ раствора МТЗ во время использования, растворив 1,67 г порошка МТЗ в темной бутылке в 1 л воды для выращивания головастиков, содержащей 0,1% ДМСО, с помощью магнитной мешалки и магнитной мешалки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: МТЗ является светочувствительным. Полное растворение может занять до 10 минут.
  2. Получение трансгенных головастиков путем естественного спаривания по линии Tg(rho:GFP-NTR)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трансгенные самцы представляют собой ценную популяцию, мы предпочитаем производить эмбрионы путем естественного спаривания, чтобы не жертвовать самцом и использовать его многократно.
    1. Прием гормонов
      1. Ввести 600 МЕ хорионического гонадотропинового гормона человека (ХГЧ) с помощью игл 25G в дорсальный лимфатический мешок самок дикого типа Xenopus laevis . Трансгенным самцам вводят 100-200 МЕ ХГЧ в дорсальный лимфатический мешок. Для мониторинга дегенерации палочек в реальном времени (шаг 2.4) используйте альбиносов Xenopus , а не пигментированных, чтобы лучше визуализировать вариации флуоресценции в глазу сгенерированных трансгенных головастиков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Женщинам Xenopus можно вводить 50 МЕ ХГЧ за 1-7 дней до запланированной овуляции, но это необязательно.
    2. Спаривание и сбор яиц
      1. Сразу после инъекции ХГЧ поместите в резервуар одного Tg(rho:GFP-NTR) трансгенного самца вместе с одной женщиной, получившей инъекцию ХГЧ, при температуре 20 °C до следующего дня. Используйте большой объем (не менее 10 л) и добавляйте небольшие предметы, к которым будут прилипать яйца, чтобы яйца не были повреждены движениями взрослых особей. На следующий день, когда лягушки уже не находятся в амплексусах, извлеките взрослых особей из аквариума и соберите эмбрионы.
    3. Выращивание эмбрионов и головастиков
      1. Стадия эмбрионов и головастиков в соответствии с нормальной таблицей развития Xenopus 9.
      2. Выращивайте эмбрионы в резервуаре, наполненном водой для выращивания головастиков. С 45 стадии кормите головастиков порошкообразным кормом для мальков и насыщайте воду кислородом с помощью барботера. При необходимости добавляйте воду ежедневно, чтобы компенсировать испарение, и еженедельно меняйте воду во всем резервуаре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы также возможен обмен 50% объема два раза в неделю. Подробный протокол можно найти в10.
    4. Сортировка трансгенных эмбрионов
      1. Начиная со стадии 37/38, сортируйте и отбирайте трансгенные эмбрионы под флуоресцентным стереомикроскопом путем прямой визуализации GFP (рис. 1C).
  3. Лечение головастиком МТЗ
    1. Пересадить трансгенных головастиков Tg(rho:GFP-NTR) в резервуар, содержащий 10 мМ раствора MTZ, и выращивать их при температуре 20 °C в темноте в течение 1 недели. В качестве контроля используют трансгенных братьев и сестер, выращенных в воде для выращивания головастиков, содержащей 0,1% ДМСО.
    2. Меняйте МТЗ и контрольный раствор через день в течение периода лечения. Кормите головастиков как обычно во время обработки МТЗ.
    3. Для индивидуального флуоресцентного мониторинга (шаг 2.4) поместите каждого головастика в небольшой контейнер с 30 мл МТЗ или контрольного раствора, начиная с шага 2.3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение МТЗ можно проводить в любое время, начиная с 45 стадии.
  4. Мониторинг дегенерации стержня в режиме реального времени
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прогрессирующую дегенерацию стержней можно отслеживать в режиме реального времени. Поэтому выполните шаги 2.4.1. по 2.4.4. до лечения МТЗ, а затем регулярно после лечения.
    1. Выполните шаги 1.1 и 1.3 для приготовления анестетика и анестезии головастика соответственно.
    2. С помощью ложки поймайте одного головастика и аккуратно положите его на влажную салфетку в небольшую чашку Петри (диаметр 55 мм). Наблюдайте флуоресценцию GFP под флуоресцентным стереомикроскопом (длина волны возбуждения = 488 нм и длина волны излучения = 509 нм) и фотографируйте глаз. Снижение интенсивности флуоресценции отражает деградацию палочек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения количественных сравнений необходимо сохранить одни и те же настройки для визуализации всех головастиков.
    3. Переложите изображенного головастика в большой резервуар, содержащий 1 л воды для выращивания, осторожно погрузив чашку Петри. Следите за головастиками до тех пор, пока они полностью не проснутся.
    4. Сравните интенсивность флуоресценции между глазами головастика, обработанными МТЗ, и глазами контрольной группы, чтобы контролировать и оценивать эффективность процесса дегенерации.

3. Дегенерация палочек путем CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута родопсина

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол создан для создания модели пигментного ретинита у Xenopus laevis путем индуцирования специфической дегенерации палочек с использованием CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута родопсина. % вставки-делеции (инделов) в F0 предусмотрен в11 и составляет ~75%. Такой CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут родопсина также может быть выполнен у головастиков Xenopus tropicalis 11.

  1. Приготовление растворов и реагентов
    1. Упорядочение крРНК и тракрРНК
      1. Купите синтетическую CRISPR РНК (crRNA), нацеленную на ген родопсина (rho) и стандартную трансактивирующую crRNA (tracrRNA). КрРНК состоит из области, специфичной для мишени rho (GCUCUGCUGUAAUACUGA) и еще одной (GUUUUAGAGCUAUGCU), которая гибридизируется с tracrRNA.
    2. крРНК:дуплекс тракрРНК (rho гРНК дуплекс)
      1. Ресуспендировать крРНК и трацрРНК при 100 мкМ в безнуклеазном дуплексном буфере.
      2. Приготовьте дуплекс гРНК, смешав 3 мкл 100 мкМ ро крРНК, 3 мкл 100 мкМ трацрРНК и 94 мкл дуплексного буфера. Конечные концентрации составляют 36 нг/мкл rho crRNA и 67 нг/мкл tracrRNA.
      3. Отожгите олиго, нагревая их при температуре 95 °C в течение 5 минут и медленно охладив до комнатной температуры. Сделайте аликвоты и храните их при температуре -20 °C.
    3. Рибонуклеопротеиновый комплекс CRISPR-Cas9 (т.е. дуплекс гРНК/белок Cas9)
      1. Во время использования приготовьте смесь из рро-гРНК-дуплекса и белка Cas9. Для 20 мкл добавляют 10 мкл дуплексного раствора ро гРНК, 2 мкл белка Cas9 (запас 5 мг/мл), 2 мкл флуоресцеина лизина декстрана (запас 10 мг/мл) и 6 мкл воды, не содержащей РНКазы.
      2. Для образования рибонуклеопротеидного комплекса инкубируют в течение 10 мин при 37 °C и дают раствору остыть до комнатной температуры.
      3. На 20 мкл контрольного раствора смешают 2 мкл белка Cas9, 2 мкл флуоресцеина лизина декстрана и 16 мкл воды, не содержащей РНКазы.
    4. Приготовление растворов 10x, 1x и 0,1x MBS
      1. Приготовьте модифицированный солевой раствор Барта (10x MBS), добавив 11,92 г HEPES, 51,43 г хлорида натрия (NaCl), 0,75 г хлорида калия (KCl), 2,1 г бикарбоната натрия (NaHCO3) и 2,46 г гептагидрата сульфата магния (MgSO4, 7 H2O) в 800 мл воды типа II. Отрегулируйте pH до 7,8 с помощью 30% гидроксида натрия (NaOH). Добавьте воду типа II до тех пор, пока объем не достигнет 1 л, и стерилизуйте в автоклаве. Хранить при комнатной температуре.
      2. Приготовьте 1 л 1x раствора MBS, разбавив 100 мл 10x раствора соли MBS и 7 мл 0,1 M дигидрата хлорида кальция (CaCl 2, 2H2O) в воде типа II. Хранить при комнатной температуре.
      3. Приготовьте 0,1x раствор MBS, разбавив 1x раствор MBS в воде типа II. Хранить при комнатной температуре.
    5. Раствор бензокаина для взрослых
      1. Приготовьте 0,05% раствор бензокаина, добавив 5 мл 10% исходного раствора бензокаина (см. шаг 1.1.1.) к 1 л воды для выращивания головастиков. Хорошо перемешайте.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Храните этот раствор в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C, защищенной от света алюминиевой фольгой. Доведите раствор до комнатной температуры перед использованием на животных.
    6. Раствор L-цистеина
      1. Во время применения приготовьте раствор для дестудинга, добавив 2 г L-цистеина соляного моногидрата к 100 мл 0,1-кратного раствора MBS. Отрегулируйте pH до 7,8 с 30% NaOH.
    7. Раствор полисахарозы
      1. Готовят густой раствор полисахарозы, добавляя 3 г полисахарозы в 100 мл 0,1х раствора MBS. Храните этот раствор в течение нескольких недель при температуре 4 °C.
  2. Экстракорпоральное оплодотворение и дежелирование
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию об экстракорпоральном оплодотворении Xenopus можно найти в подробном специальном протоколе вразделе 12.
    1. Введение гормона самкам Xenopus laevis для стимуляции овуляции
      1. Примерно за 15 ч до забора ооцитов введите 600 МЕ ХГЧ в дорсальный лимфатический мешок самки и оставьте на ночь при температуре 18 °C.
    2. Рассечение яичек
      1. Усыпить самца Xenopus смертельной дозой 0,05% раствора бензокаина в течение 10-15 мин. В качестве дополнительного метода эвтаназии острыми и прочными ножницами перерезайте позвоночник непосредственно позади черепа. Вскройте брюшную полость ножницами для препарирования, вырежьте семенники и удалите прилипший жир и капилляры. Немедленно поместите каждое яичко на лед в 1 мл 1x MBS.
    3. Подготовка спермы
      1. Измельчите один тестис с помощью пестика для пробирок для микроцентрифуг и разведите суспензию в пробирке объемом 15 мл, содержащей 9 мл 1x MBS. Добавьте 10 мкг/мл гентамицина во вторую пробирку с яичками и держите ее при температуре 4 °C в течение нескольких дней для дальнейших экспериментов по оплодотворению.
    4. Экстракорпоральное оплодотворение
      1. Аккуратно помассируйте спину самки, получившей инъекцию гормона, и соберите яйцеклетки в чашку Петри (диаметр 100 мм). Нанесите несколько капель раствора сперматозоидов на яйцеклетки. Подождите 5 минут и накройте их 0,1x MBS. Подождите 10 минут, прежде чем приступать к дежелированию.
    5. Дежелирование оплодотворенных яйцеклеток
      1. Замените 0,1x раствор MBS раствором для дежелирования, чтобы удалить желейную оболочку с оплодотворенных яйцеклеток (~ 5 мин). Тщательно промыть эмбрионы 5-6 раз 0,1х МБС и переложить их в новую чашку Петри диаметром 100 мм, наполненную 0,1х МБС.
  3. Подготовка системы микроинъекций
    1. Заточить стеклянные капилляры съемникоммикропипетки 13.
    2. Наполните заостренный капилляр 2-10 мкл рибонуклеопротеидного комплекса CRISPR-Cas9 или контрольного раствора с помощью наконечника микрозагрузчика и поместите капилляр в манипулятор микроинъектора.
    3. При максимальном увеличении стереомикроскопа отломите кончик капилляра тонкими щипцами и отрегулируйте время инъекции (~400 мс), чтобы получить объем выброса 10 нл за импульс. Установите давление выброса около 40 фунтов на квадратный дюйм.
  4. Одноэтапная микроинъекция эмбриона с рибонуклеопротеидным комплексом CRISPR-Cas9
    1. Поместите одноклеточные эмбрионы на сетку (нейлоновая ткань толщиной 1 мм), склеенную в чашку Петри диаметром 100 мм, наполненную 3% раствором полисахарозы (рис. 1D).
    2. С помощью микроинъектора и под стереомикроскопом вводят 10 нл рибонуклеопротеидного комплекса CRISPR-Cas9 (что соответствует 500 пг дуплекса гРНК + 5 нг белка Cas9 на эмбрион) или контрольный раствор на уровне полюса животного, в кортикальной области, непосредственно под цитоплазматической мембраной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцеин лизин декстран, содержащийся в растворе, позволяет проводить последующую сортировку введенных эмбрионов.
    3. Перенесите введенные эмбрионы в новую чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую чистый раствор полисахарозы, и поместите их при температуре 21 °C.
    4. В первый день регулярно отсортируйте хорошо развитые эмбрионы и замените раствор полисахарозы 0,1х МБС примерно через 5 ч после микроинъекции.
    5. Подождите 24 ч после инъекции, чтобы отсортировать и отобрать хорошо введенные эмбрионы с хрустящим ро под флуоресцентным стереомикроскопом путем визуализации флуоресцеина лизина декстрана (рис. 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем раньше будет сделана микроинъекция после оплодотворения, тем эффективнее нокаут.
  5. Выращивание эмбрионов и головастиков
    1. Выращивать хрустящие эмбрионы в 0,1x MBS в чашках Петри до стадии 37/38. Ежедневно удаляйте мертвые эмбрионы и меняйте 0,1-кратный раствор MBS. Начиная со стадии 37/38, выращивайте эмбрионы в резервуаре, наполненном водой для выращивания головастиков, а начиная со стадии 45, действуйте, как в шаге 2.2.3.

4. Дегенерация клеток сетчатки путем цитотоксических внутриглазных инъекций CoCl 2

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол разработан для индуцирования дегенерации клеток сетчатки путем внутриглазных инъекций хлорида кобальта (CoCl2) головастикам Xenopus laevis . В зависимости от дозы он может вызвать конусоспецифическую дегенерацию или более широкую дегенерацию14. Мы используем этот протокол для головастиков Xenopus laevis в возрасте от 48 стадии. Его также можно использовать у головастиков Xenopus tropicalis .

  1. Приготовление буфера и реагентов
    1. Приготовьте 0,005% раствор бензокаина во время использования, как в шаге 1.1.
    2. Приготовьте 100 мМ исходного раствора CoCl2 , добавив 118,5 мг к 5 мл 0,1x MBS (см. шаг 3.1.4 для приготовления 0,1x MBS). Храните этот исходный раствор в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C, защищая от света алюминиевой фольгой.
      ВНИМАНИЕ: CoCl2 классифицируется как токсичное соединение для жизни человека и животных. Внимательно следуйте инструкциям по обращению, хранению и утилизации отходов, приведенным в паспорте безопасности.
    3. Для дигенерации, специфичной для конуса, готовят 10 мМ раствора CoCl2 во время использования из 100 мМ исходного раствора, разбавленного в 0,1х МБС. Для более широкой дегенерации клеток сетчатки приготовьте 25 мМ раствора CoCl2 .
  2. Подготовка системы впрыска
    1. Заточить стеклянные капилляры съемником микропипетки 13.
    2. Наполните заточенный капилляр 2-10 мкл 10 или 25 мМ раствора CoCl2 или контрольного раствора (0,1x MBS) с помощью наконечника микрозагрузчика и поместите капилляр в манипулятор микроинжектора.
    3. При максимальном увеличении стереомикроскопа отломите кончик капилляра тонкими щипцами и отрегулируйте время инъекции (примерно 100 мс), чтобы получить объем выброса 15-40 нл на импульс. Установите давление выброса на ~40 фунтов на квадратный дюйм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер капли должен соответствовать стадии головастиков и размеру их глаз. Например, на стадиях 48-49 размер капли составляет ~15-20 нл, а на стадии 52-56 - 30-40 нл. Визуально размер капли немного больше, чем размер объектива.
  3. Внутриглазные инъекции CoCl2
    1. Используйте сачок, чтобы поймать головастиков в их аквариумах. Перелейте их в 50 мл 0,005% раствора бензокаина. Подождите несколько минут, пока головастики не перестанут реагировать на раздражители.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько головастиков могут быть обезболены одновременно, но время, проведенное в анестезии, должно быть менее 30 минут.
    2. С помощью ложки поймайте одного головастика и осторожно положите его в небольшую чашку Петри (диаметр 55 мм), содержащую влажную салфетку. Расположите головастика дорсальной стороной вверх в середине чашки Петри (рис. 1F,G).
    3. Используйте микроинъектор под стереомикроскопом для интраокулярного введения раствора CoCl2 . Аккуратно вставьте капилляр в глаз поверх хрусталика. Когда кончик капилляра окажется внутри глаза, выбросьте две капли на глаз. После инъекции в правый глаз поверните чашку Петри вручную на 180°, чтобы сделать инъекцию в левый глаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что инъекция делается внутрь глаза, поэтому после каждого выброса раствора должен быть виден небольшой отек глаза. Головастик должен как можно меньше находиться вне воды. Инъекция в оба глаза должна занять не более 1 минуты.
    4. Переложите введенного головастика в большой резервуар, содержащий 1 л воды для выращивания, осторожно погрузив его в чашку Петри (рисунок 1H). Следите за головастиками до тех пор, пока они полностью не проснутся.

5. Окрашивание для оценки повреждения или дегенерации сетчатки

  1. Фиксация и обезвоживание головастиков
    1. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA), разбавив 100 мл 32% раствора PFA в 700 мл 1x PBS. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH. Аликвотируют этот исходный раствор и консервируют его в течение нескольких месяцев при температуре -20 °C.
    2. Усыпьте головастиков 0,01% бензокаином и переложите их во флакон, содержащий 4% PFA, на 2 ч при комнатной температуре с перемешиванием или на ночь при 4 °C. Полоскание 3 раза по 5 минут в 1 жидком растворе PBS.
    3. Постепенно обезвоживайте головастиков путем последовательных 30-минутных инкубаций в 70% и 95% этаноле (разбавленном водой типа II), а затем еще три инкубации по 1 ч в 100% этаноле. Храните головки головастиков на этом этапе при температуре -20 °C или непосредственно переведите их в 100% бутанол на ночь для дальнейших действий.
  2. Парафиновое секционирование
    1. Замените 100% бутанол расплавленным парафином в течение 2 ч при 62 °C. Замените парафин на 2 x 2 ч дополнительной инкубации при 62 °C.
    2. Переложите головки головастиков в одноразовые формы для закладки парафина и сориентируйте их так, чтобы их глаза были хорошо выровнены, а затем дайте парафину застыть. Храните блоки при комнатной температуре.
    3. Обрежьте излишки парафина и закрепите блок с вложенными головастиками на опору микротома.
    4. Разрежьте блок микротомом соответствующей толщины (10-12 мкм). Перенесите ленты с участками на предметное стекло, предварительно покрытое 3%-ным глицериновым альбумином (разведенным в воде).
    5. Поместите предметное стекло на подогреватель предметных стекол при температуре 42 °C на несколько минут, а затем удалите излишки глицеринового альбумина. Дайте слайдам высохнуть в течение ночи в духовке при температуре 37 °C.
    6. Депарафинизация, погружение предметных стекол на 2 x 15 минут в банку Coplin, наполненную 100% ксилолом. Регидратация срезов с дифференцированным количеством этанола: 100% дважды, 70%, 50% (разбавленные водой типа II), ~5 мин каждая, затем 2 x 5 мин в воде.
  3. Иммунофлуоресцентное мечение
    1. Приготовьте 100 мМ исходного раствора цитрата натрия (CiNa), добавив 29,4 г дигидрата тринатриевой соли цитрата натрия (C6H5Na3O7, 2H2O) в 1 л воды типа II; отрегулируйте pH до 6 с помощью соляной кислоты (HCl). Стерилизовать автоклавом и хранить при комнатной температуре несколько месяцев. Приготовьте демаскирующий раствор во время использования, добавив 25 мл 100 мМ исходного раствора CiNa к 225 мл воды типа II. Добавьте 125 мкл Tween-20 и хорошо перемешайте (конечная концентрация 10 мМ CiNa, 0,05% Tween-20).
    2. Приготовьте исходный раствор Хёхста в концентрации 10 мг/мл, добавив 100 мг бисбензимида H 33258 к 10 мл воды типа I. Храните этот исходный раствор в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C, защищая от света алюминиевой фольгой. Приготовьте раствор Хёхста в концентрации 7,5 мкг/мл, добавив 300 мкл исходного раствора Хёхста к 400 мл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно использовать до 10 раз и хранить около 6 месяцев при температуре 4 °C, защищая от света алюминиевой фольгой.
    3. После депарафинизации срезов проводят извлечение антигена путем кипячения срезов в демаскирующий раствор в течение 9 мин. Дайте раствору остыть в течение 20 минут.
    4. Промыть один раз в воде типа II и один раз в 1x PBS. Положите предметные стекла во влажную камеру и добавьте 400-600 мкл блокирующего раствора на предметное стекло (разбавитель антител + 0,2% Triton X100) в течение 30 минут.
    5. Замените блокирующий раствор на 200 мкл на предметное стекло первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе. Используйте покровный листок, чтобы распределить раствор по срезам, избегая образования пузырей. Выдерживают в течение ночи при температуре 4 °C во влажной камере.
    6. Переложите предметные стекла в банку Coplin и промывайте в течение 3 x 10 мин в 1x PBS с добавлением 0,1 % Triton X100. Положите предметные стекла на плашмя, добавьте 400 мкл на предметное стекло вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе, и оставьте на 2 ч при комнатной температуре во влажной камере.
    7. Переложите предметные стекла в банку Coplin и промывайте в течение 3 x 5 минут 1x PBS с добавлением 0,1% Triton X100.
    8. Окрасить ядра клеток раствором Хёхста в течение 10 мин и промыть 3 раза 5 мин 1 ПБС.
    9. Поместите покровные стекла поверх слайдов в водную монтажную среду, специально предназначенную для сохранения флуоресценции. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение 1 часа при комнатной температуре и храните их при температуре 4 °C.
    10. Визуализируйте предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа.
  4. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) для оценки повреждения сетчатки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо того, чтобы помечать определенный тип клеток с помощью иммуноокрашивания, общая гистология сетчатки может быть оценена с помощью H&E окраски.
    1. После депарафинизации срезов выполняют мечение нуклеиновыми кислотами, погружая предметные стекла в раствор гематоксилина на 2 мин. Хорошо промыть водопроводной водой.
    2. Мечение цитоплазмы проводят путем погружения предметных стекол в 1% раствор эозина на 1 мин. Быстро смойте водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эозин хорошо растворяется; Если горки оставить в воде слишком долго, весь краситель исчезнет.
    3. Промывайте 2 x 5 мин в 100% этаноле и 2 x 5 мин в ксилоле.
    4. Под капотом поместите покровные стекла поверх направляющих в 4-5 каплях монтажного средства. Дайте предметным стеклам высохнуть под колпаком и на следующий день сделайте снимок с помощью микроскопа.
  5. Обнаружение апоптотических клеток
    1. После депарафинизации срезов (см. раздел 5.2.6) следуйте протоколу производителя набора, чтобы обнаружить апоптотическую фрагментацию ДНК.
    2. Окрашивание ядер проводят путем погружения предметных стекол в раствор Хёхста (см. раздел 5.3.8) и монтируют с помощью водной монтажной среды, специально разработанной для сохранения флуоресценции. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение 1 часа при комнатной температуре и храните их при температуре 4 °C.
    3. Визуализируйте предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа.

Результаты

Механическая травма сетчатки
Срезы сетчатки головастиков, подвергшиеся механической травме, описанной в разделе 1 протокола, показывают, что поражение сетчатки охватывает все слои ткани, оставаясь ограниченным местом прокола (рис. 2А,Б).

Обсуждение

Преимущества и недостатки различных парадигм повреждения сетчатки у головастиков Xenopus

Механическая травма сетчатки
У головастиков Xenopus развились различные хирургические повреждения нервной сетчатки. Нервная сетчатка может быть удалена л?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Исследование выполнено при поддержке грантов Ассоциации сетчатки Франции, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) и UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) в партнерстве с ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, Sciences Cognitives, Neneurologye, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Propanediol (propylène glycol)Sigma-Aldrich398039
Absolute ethanol ≥99.8%VWR chemicals20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)Cell signaling9661SDilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)AveslabsGFP-1020Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5405Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11005Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)AbcamAb183951Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11008Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11012Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5585Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)Sigma-AldrichMABN15Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5407Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)PromegaG3250
Benzocaine Sigma-AldrichE1501Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%VWR chemicals20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Apparatus)30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab diluent AgilentS202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Electronic Rotary MicrotomeThermo ScientificMicrom HM 340E 
Eosin 1% aqueousRAL Diagnostics312740
Fluorescein lysine dextran  Invitrogen Thermo ScientificD1822
Fluorescent stereomicroscopeOlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
Glycerin albumin acc. MalloryDiapathE0012Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES potassium saltSigma-AldrichH0527
Human chorionic gonadotropin hormoneMSD Animal HealthChorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC7880Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazole Sigma-Aldrich (Supelco)M3761Use at 10 mM
Microloader tipsEppendorf5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.Model P-97Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave ReagentMillipore345789
Mounting medium, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome bladeEpredia3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µmSefar06-1000/44
Paraffin histowax without DMSOHistolab00403
Paraformaldehyde solution (32%)Electron Microscopy SciencesEM-15714-SUse at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsEpredia2219
PestleVWR431-0094
Petri Dish 100 mmCorning GosselinSB93-101
Petri Dish 55 mmCorning GosselinBP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer Microinjection systemParker Instrumentation ProductsPicoSpritzer III
Pins Fine Science Tools26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )Sigma-AldrichF4375Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Powdered fry food : sera Micron Naturesera45475 (00720)
Scissors dissectionFine Science Tools14090-09
Slide Superfrost  KNITTEL GlassVS11171076FKA 
Slide warmerKunz instrumentsHP-3
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)VWR chemicals27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich (Supelco)1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)VWR chemicals28217-292
StereomicroscopeZeissStemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mLB-BRAUN9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)Integrated DNA Technologies1072533
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC Fluorescence IlluminatorX-Cite 200DC
Xylene ≥98.5% VWR chemicals28975-325

Ссылки

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

XenopusM 252M 252CRISPR Cas9CoCl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены