Génération de modèles de lésions rétiniennes chez les têtards Xénope

Résumé

Nous avons développé plusieurs protocoles pour induire des lésions rétiniennes ou une dégénérescence rétinienne chez les têtards de Xenopus laevis . Ces modèles offrent la possibilité d’étudier les mécanismes de régénération rétinienne.

Résumé

Les maladies neurodégénératives de la rétine sont les principales causes de cécité. Parmi les nombreuses stratégies thérapeutiques explorées, la stimulation de l’autoréparation s’est récemment révélée particulièrement attrayante. Une source cellulaire d’intérêt pour la réparation de la rétine est la cellule gliale de Müller, qui abrite un potentiel de cellules souches et une capacité de régénération extraordinaire chez les anamniotes. Ce potentiel est cependant très limité chez les mammifères. L’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération rétinienne dans des modèles animaux dotés de capacités de régénération devrait permettre de mieux comprendre comment libérer la capacité latente des cellules de Müller chez les mammifères à régénérer la rétine. Il s’agit d’une étape clé pour le développement de stratégies thérapeutiques en médecine régénérative. Dans ce but, nous avons développé plusieurs paradigmes de lésions rétiniennes dans Xenopus : une lésion mécanique de la rétine, une lignée transgénique permettant l’ablation conditionnelle des photorécepteurs médiée par la nitroréductase, un modèle de rétinite pigmentaire basé sur le knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9, et un modèle cytotoxique piloté par des injections intraoculaires de CoCl₂ . En mettant en évidence leurs avantages et leurs inconvénients, nous décrivons ici cette série de protocoles qui génèrent diverses conditions dégénératives et permettent l’étude de la régénération rétinienne chez Xenopus.

Introduction

Des millions de personnes dans le monde sont atteintes de diverses maladies dégénératives de la rétine conduisant à la cécité, telles que la rétinite pigmentaire, la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). À ce jour, ces affections restent en grande partie incurables. Les approches thérapeutiques actuellement à l’étude comprennent la thérapie génique, les transplantations de cellules ou de tissus, les traitements neuroprotecteurs, l’optogénétique et les prothèses. Une autre stratégie émergente est basée sur l’auto-régénération par l’activation de cellules endogènes ayant un potentiel de cellules souches. Les cellules gliales de Müller, le principal type de cellules gliales de la rétine, font partie des sources cellulaires d’intérêt dans ce contexte. En cas de blessure, ils peuvent se dédifférencier, proliférer et générer des neurones ^1,2,3. Bien que ce processus soit très efficace chez le poisson-zèbre ou le Xénope, il est largement inefficace chez les mammifères.

Néanmoins, il a été démontré que des traitements appropriés avec des protéines mitogènes ou une surexpression de divers facteurs peuvent induire la réentrée dans le cycle des cellules gliales de Müller chez les mammifères et, dans certains cas, déclencher leur engagement neurogénique ultérieur 1,2,3,4,5. Cela reste cependant largement insuffisant pour les traitements. Par conséquent, il est nécessaire d’accroître nos connaissances sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération afin d’identifier des molécules capables de transformer efficacement les propriétés des cellules souches de Müller en nouvelles stratégies thérapeutiques cellulaires.

Dans ce but, nous avons développé plusieurs paradigmes de lésions dans Xenopus qui déclenchent la dégénérescence des cellules rétiniennes. Ici, nous présentons (1) une lésion mécanique de la rétine qui n’est pas spécifique à un type de cellule, (2) un modèle d’ablation cellulaire conditionnelle et réversible utilisant le système NTR-MTZ qui cible les cellules en bâtonnets, (3) un knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9, un modèle de rétinite pigmentaire qui déclenche une dégénérescence progressive des cellules en bâtonnet, et (4) un CoCl₂-modèle cytotoxique induit qui, selon la dose, peut cibler spécifiquement les cônes ou conduire à une dégénérescence plus large des cellules rétiniennes. Nous mettons en évidence les particularités, les avantages et les inconvénients de chaque paradigme.

Protocole

Les soins aux animaux et l’expérimentation ont été menés conformément aux lignes directrices de l’établissement, en vertu de la licence de l’établissement A91272108. Les protocoles d’étude ont été approuvés par le comité institutionnel de protection animale CEEA #59 et ont reçu l’autorisation de la Direction Départementale de la Protection des Populations sous les numéros de référence APAFIS #32589-2021072719047904 v4 et APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ces protocoles.

1. Lésion mécanique de la rétine

REMARQUE : Le protocole paradigmatique de blessure décrit ici consiste en une ponction mécanique de la rétine d’un têtard à partir du stade 45. Il ne cible donc aucun type particulier de cellules rétiniennes, mais endommage toute l’épaisseur de la rétine au site de ponction.

1. Préparation de l’anesthésique pour les têtards
   1. Préparez une solution mère à 10 % de benzocaïne. Pour un volume total de 10 mL, ajouter 1 g de benzocaïne, 2 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 8 mL de propylène glycol. Conserver la solution mère pendant plusieurs mois à 4 °C à l’abri de la lumière avec du papier aluminium.
   2. Préparer une solution de benzocaïne à 0,005 % au moment de l’utilisation en ajoutant 25 μL de solution mère de benzocaïne à 10 % à 50 mL d’eau d’élevage de têtards (eau du robinet filtrée et déchlorée). Bien mélanger.
      REMARQUE : La concentration de benzocaïne est particulièrement faible car les têtards sont très sensibles à l’anesthésie par rapport aux adultes.
2. Préparation des épingles
   1. Fixez une broche stérile de 0,2 mm de diamètre à un porte-goupille stérilisé (Figure 1A).
3. Anesthésie têtard
   1. Utilisez une épuisette pour attraper les têtards dans leurs bassins. Transférez-les dans un nouveau réservoir contenant la solution de benzocaïne à 0,005 %. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que les têtards cessent de réagir aux stimuli (tapotement du réservoir ou contact direct).
      REMARQUE : Plusieurs têtards peuvent être anesthésiés simultanément, mais le temps passé dans la solution anesthésique doit être inférieur à 30 minutes.
4. Ponction rétinienne
   1. À l’aide d’une cuillère, attrapez un têtard et placez-le soigneusement sur une petite boîte de Pétri (55 mm de diamètre) contenant un mouchoir humide. Placez le têtard face dorsale vers le haut au milieu de la boîte de Pétri.
   2. À l’aide d’un stéréomicroscope, ponctionnez la rétine en insérant doucement la broche sur la face dorsale de l’œil, jusqu’à ce qu’elle traverse la rétine (Figure 1A). Si plusieurs piqûres sont nécessaires, répétez cette procédure à différents endroits. Après avoir perforé l’œil droit, tournez la boîte de Pétri de 180° pour percer l’œil gauche.
   3. Transvaser le têtard lésionné dans un grand réservoir contenant 1 L d’eau d’élevage en immergeant délicatement la boîte de Pétri. Surveillez les têtards jusqu’à ce qu’ils soient complètement réveillés.

2. Ablation conditionnelle des cellules en bâtonnets à l’aide du système NTR-MTZ

Le protocole vise à induire une ablation spécifique des bâtonnets dans la lignée transgénique⁶ du Xénope Tg(rho :GFP-NTR), disponible au service zootechnique de TEFOR Paris-Saclay, qui héberge le centre de ressources français Xénope. Ce système chimiogénétique utilise la capacité de l’enzyme nitroréductase (NTR) à convertir le métronidazole (MTZ) en un agent de réticulation cytotoxique de l’ADN, afin d’ablater spécifiquement les bâtonnets exprimant NTR (Figure 1B). Deux protocoles détaillés pour rendre les animaux transgéniques Tg(rho :GFP-NTR) ou Tg(rho :NTR) et induire la dégénérescence ont été publiés précédemment ^7,8. Ici, nous détaillons simplement l’induction de la dégénérescence rétinienne et comment surveiller le processus de dégénérescence in vivo.

1. Préparation d’une solution de métronidazole
   1. Préparer 10 mM de solution MTZ au moment de l’utilisation en dissolvant 1,67 g de poudre de MTZ dans un flacon foncé dans 1 L d’eau d’élevage de têtards contenant 0,1 % de DMSO, à l’aide d’une barre d’agitation magnétique et d’un agitateur magnétique.
      REMARQUE : MTZ est sensible à la lumière. La dissolution complète peut prendre jusqu’à 10 minutes.
2. Génération de têtards transgéniques par accouplement naturel à partir de la lignée Tg(rho :GFP-NTR)
   NOTE : Les mâles transgéniques représentant un stock précieux, nous préférons générer des embryons par accouplement naturel pour ne pas sacrifier le mâle et l’utiliser à plusieurs reprises.
   1. Administration d’hormones
      1. Injecter 600 UI d’hormone gonadotrophine chorionique humaine (hCG) avec des aiguilles de 25G dans le sac lymphatique dorsal des femelles sauvages de Xenopus laevis . Injecter aux mâles transgéniques 100 à 200 UI d’hCG dans le sac lymphatique dorsal. Pour la surveillance en direct de la dégénérescence des bâtonnets (étape 2.4), utilisez des xénobus albinos plutôt que des xénopes pigmentés, afin de mieux visualiser les variations de fluorescence à travers l’œil des têtards transgéniques générés.
         REMARQUE : Les femelles Xénope peuvent être amorcées avec 50 UI d’hCG 1 à 7 jours avant l’ovulation prévue, mais cela est facultatif.
   2. Accouplement et collecte des œufs
      1. Immédiatement après l’injection d’hCG, mettre dans un réservoir un mâle transgénique Tg(rho :GFP-NTR) avec une femelle injectée d’hCG à 20 °C jusqu’au lendemain. Utilisez un grand volume (au moins 10 L) et ajoutez de petits objets auxquels les œufs peuvent adhérer, afin que les œufs ne soient pas endommagés par les mouvements des adultes. Le lendemain, lorsque les grenouilles ne sont plus dans l’amplexus, retirez les adultes du bac et prélevez les embryons.
   3. Élevage d’embryons et de têtards
      1. Stade embryonnaire et têtard selon le tableau normal du développement du xénope ⁹.
      2. Élevez les embryons dans un réservoir rempli d’eau d’élevage de têtards. À partir de l’étape 45, nourrissez les têtards avec de la nourriture pour alevins en poudre et oxygénez l’eau avec un barboteur. Ajoutez de l’eau tous les jours si nécessaire pour compenser l’évaporation et changez l’eau de tout le réservoir chaque semaine.
         REMARQUE : Alternativement, il est également possible d’échanger 50% du volume deux fois par semaine. Un protocole détaillé se trouve dans¹⁰.
   4. Tri d’embryons transgéniques
      1. À partir des stades 37/38, trier et sélectionner les embryons transgéniques sous un stéréomicroscope à fluorescence en visualisant directement la GFP (Figure 1C).
3. Traitement Tadpole MTZ
   1. Transférer les têtards transgéniques Tg(rho :GFP-NTR) dans un réservoir contenant 10 mM de solution MTZ et les élever à 20 °C dans l’obscurité pendant 1 semaine. Utiliser des frères et sœurs transgéniques élevés dans de l’eau d’élevage de têtards contenant 0,1 % de DMSO comme témoins.
   2. Changez la MTZ et la solution de contrôle tous les deux jours pendant la période de traitement. Nourrissez les têtards comme d’habitude pendant le traitement MTZ.
   3. Pour la surveillance individuelle de la fluorescence (étape 2.4), placer chaque têtard dans son petit récipient contenant 30 mL de MTZ ou de solution témoin à partir de l’étape 2.3.1.
      REMARQUE : Le traitement MTZ peut être effectué à tout moment à partir du stade 45.
4. Surveillance en direct de la dégénérescence des bâtonnets
   REMARQUE : La dégénérescence progressive des tiges peut être surveillée en temps réel. Par conséquent, effectuez les étapes 2.4.1. à 2.4.4. avant le traitement MTZ, puis régulièrement après le traitement.
   1. Suivez les étapes 1.1 et 1.3 pour la préparation de l’anesthésique et de l’anesthésie têtarde, respectivement.
   2. À l’aide d’une cuillère, attrapez un têtard et placez-le soigneusement sur un mouchoir humide dans une petite boîte de Pétri (55 mm de diamètre). Observer la fluorescence GFP sous un stéréomicroscope à fluorescence (longueur d’onde d’excitation = 488 nm et longueur d’onde d’émission = 509 nm) et prendre des photos de l’œil. Une diminution de l’intensité de la fluorescence reflète la dégradation des bâtonnets.
      REMARQUE : Pour effectuer des comparaisons quantitatives, les mêmes paramètres doivent être conservés pour l’imagerie de tous les têtards.
   3. Transférez le têtard illustré dans un grand réservoir contenant 1 L d’eau d’élevage en immergeant soigneusement la boîte de Pétri. Surveillez les têtards jusqu’à ce qu’ils soient complètement réveillés.
   4. Comparez l’intensité de fluorescence entre les yeux de têtard traités par MTZ et les yeux de têtard témoins pour surveiller et évaluer l’efficacité du processus de dégénérescence.

3. Dégénérescence des cellules en bâtonnets par knock-out de la rhodopsine médiée par CRISPR/Cas9

NOTE : Ce protocole est établi pour générer un modèle de rétinite pigmentaire chez Xenopus laevis en induisant une dégénérescence spécifique des cellules en bâtonnets à l’aide du knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9. Le % d’insertion-délétion (indels) dans F0 est fourni en¹¹ et est de ~75%. Un tel knock-out de la rhodopsine médié par CRISPR/Cas9 peut également être effectué chez les têtards de Xenopus tropicalis ¹¹.

1. Préparation des solutions et des réactifs
   1. Ordonnancement de l’ARNcr et de l’ARNtracr
      1. Achetez l’ARN synthétique CRISPR (ARNcr) ciblant le gène de la rhodopsine (rho) et l’ARNcr trans-activateur standard (ARNtracr). L’ARNcr est composé d’une région spécifique à la cible rho (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) et d’une autre (GUUUUAGAGCUAUGCU) qui s’hybride à l’ARNtracr.
   2. ARNcr : duplex d’ARNtracr (duplex d’ARNg rho )
      1. Remettre en suspension l’ARNcr et l’ARNtracr à 100 μM dans le tampon duplex sans nucléase.
      2. Préparez l’ARNg duplex en mélangeant 3 μL d’ARNcr rho de 100 μM, 3 μL d’ARNtracr de 100 μM et 94 μL de tampon duplex. Les concentrations finales sont de 36 ng/μL d’ARNcr rho et de 67 ng/μL d’ARNtracr.
      3. Recuire les oligos en les chauffant à 95 °C pendant 5 min et les refroidir lentement à température ambiante. Préparez des aliquotes et conservez-les à -20 °C.
   3. Complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9 (c.-à-d. ARNg duplex/protéine Cas9)
      1. Au moment de l’utilisation, préparez le mélange de rho gRNA duplex et de la protéine Cas9. Pour 20 μL, ajouter 10 μL de solution duplex d’ARNg rho , 2 μL de protéine Cas9 (bouillon à 5 mg/mL), 2 μL de fluorescéine lysine dextran (bouillon à 10 mg/mL) et 6 μL d’eau exempte de RNase.
      2. Pour former le complexe ribonucléoprotéique, incuber pendant 10 min à 37 °C et laisser refroidir la solution à température ambiante.
      3. Pour 20 μL de la solution témoin, mélanger 2 μL de protéine Cas9, 2 μL de fluorescéine lysine dextran et 16 μL d’eau exempte de RNase.
   4. Préparation de solutions MBS 10x, 1x et 0,1x
      1. Préparer la solution mère saline de Barth modifiée (10x MBS) en ajoutant 11,92 g de HEPES, 51,43 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,75 g de chlorure de potassium (KCl), 2,1 g de bicarbonate de sodium (NaHCO₃) et 2,46 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO₄, 7 H₂O) dans 800 mL d’eau de type II. Ajustez le pH à 7,8 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH) à 30 %. Ajouter de l’eau de type II jusqu’à ce que le volume atteigne 1 L et stériliser à l’autoclave. Conserver à température ambiante.
      2. Préparer 1 L de solution de MBS 1x en diluant 100 mL de solution saline de 10x MBS et 7 mL de chlorure de calcium dihydraté 0,1 M (CaCl 2, 2H₂ O) dans de l’eaude type II. Conserver à température ambiante.
      3. Préparez 0,1x solution de MBS en diluant 1x solution de MBS dans de l’eau de type II. Conserver à température ambiante.
   5. Solution de benzocaïne pour adultes
      1. Préparer une solution de benzocaïne à 0,05 % en ajoutant 5 mL de solution mère de benzocaïne à 10 % (voir l’étape 1.1.1.) à 1 L d’eau d’élevage de têtards. Bien mélanger.
         REMARQUE : Conserver cette solution pendant plusieurs mois à 4 °C à l’abri de la lumière avec du papier d’aluminium. Amenez la solution à température ambiante avant de l’utiliser sur les animaux.
   6. Solution de L-cystéine
      1. Préparez la solution de dégraissage au moment de l’utilisation en ajoutant 2 g de L-cystéine chlorhydrique monohydratée à 100 mL de solution 0,1x MBS. Ajustez le pH à 7,8 avec 30 % de NaOH.
   7. Solution de polysaccharose
      1. Préparez la solution dense de polysaccharose en ajoutant 3 g de polysaccharose à 100 mL de solution 0,1x MBS. Conservez cette solution pendant quelques semaines à 4 °C.
2. Fécondation in vitro et dégélification
   REMARQUE : Plus de détails sur la fécondation in vitro de Xénope peuvent être trouvés dans un protocole dédié détaillé dans¹².
   1. Administration d’hormones aux femelles Xenopus laevis pour induire l’ovulation
      1. Environ 15 h avant le prélèvement de l’ovocyte, injecter 600 UI d’hCG dans le sac lymphatique dorsal de la femelle et le conserver toute la nuit à 18 °C.
   2. Dissection testiculaire
      1. Euthanasier le mâle Xénope avec une dose létale de solution de benzocaïne à 0,05 % pendant 10 à 15 minutes. Comme méthode complémentaire d’euthanasie, sectionnez la colonne vertébrale immédiatement postérieure au crâne avec des ciseaux tranchants et robustes. Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux de dissection, coupez les testicules et coupez la graisse et les capillaires attachés. Placez immédiatement chaque testicule sur de la glace dans 1 mL de 1x MBS.
   3. Préparation du sperme
      1. Écraser un testicule à l’aide d’un pilon pour tubes de microcentrifugation et diluer la suspension dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de MBS 1x. Ajouter 10 μg/mL de gentamicine dans le deuxième tube testiculaire et le maintenir à 4 °C pendant quelques jours pour d’autres expériences de fécondation.
   4. Fécondation in vitro
      1. Massez doucement le dos de la femme à qui l’on a injecté des hormones et prélevez les ovocytes dans une boîte de Pétri (100 mm de diamètre). Étalez quelques gouttes de la solution de sperme dans les ovocytes. Attendez 5 min et couvrez-les avec 0,1x MBS. Attendez 10 min avant de procéder au dégélage.
   5. Dégélification d’oeufs fécondés
      1. Remplacez la solution de MBS 0,1x par la solution de dégelage pour enlever la couche de gelée des œufs fécondés (~5 min). Rincez abondamment les embryons 5 à 6 fois avec 0,1x MBS et transférez-les dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm remplie de 0,1x MBS.
3. Préparation du système de micro-injection
   1. Affûter les capillaires en verre à l’aide d’un extracteur de micropipette¹³.
   2. Remplissez un capillaire aiguisé avec 2 à 10 μL de complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9 ou la solution de contrôle à l’aide d’une pointe de microchargeur et placez le capillaire dans le manipulateur de micro-injecteurs.
   3. Au grossissement le plus élevé d’un stéréomicroscope, cassez l’extrémité capillaire à l’aide d’une pince fine et ajustez le temps d’injection (~400 ms) pour obtenir un volume d’éjection de 10 nL par impulsion. Réglez la pression d’éjection à environ 40 PSI.
4. Micro-injection d’embryons unicellulaires avec le complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9
   1. Placer les embryons unicellulaires sur une grille (tissu de nylon de 1 mm) collés dans une boîte de Pétri de 100 mm remplie d’une solution de polysaccharose à 3 % (Figure 1D).
   2. À l’aide du micro-injecteur et sous stéréomicroscope, injecter 10 nL du complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9 (ce qui correspond à 500 pg d’ARNg duplex + 5 ng de protéine Cas9 par embryon) ou une solution témoin au niveau du pôle animal, dans la région corticale, juste sous la membrane cytoplasmique.
      REMARQUE : La fluorescéine lysine dextran contenue dans la solution permet un tri ultérieur des embryons injectés.
   3. Transférez les embryons injectés dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm contenant une solution propre de polysaccharose et placez-les à 21 °C.
   4. Le premier jour, triez régulièrement les embryons bien développés et remplacez la solution de polysaccharose par 0,1x MBS environ 5 h après la micro-injection.
   5. Attendre 24 h après l’injection pour trier et sélectionner les embryons rho crispant bien injectés sous un stéréomicroscope fluorescent en visualisant la fluorescéine lysine dextran (Figure 1E).
      REMARQUE : Plus la micro-injection est précoce après la fécondation, plus le knock-out est efficace.
5. Élevage d’embryons et de têtards
   1. Élever des embryons rho crispant dans 0,1x MBS dans des boîtes de Pétri jusqu’au stade 37/38. Retirez les embryons morts tous les jours et changez la solution MBS 0,1x. À partir du stade 37/38, élever les embryons dans un réservoir rempli d’eau d’élevage de têtards, et à partir du stade 45, procéder comme à l’étape 2.2.3.

4. Dégénérescence des cellules rétiniennes par injections intraoculaires cytotoxiques de CoCl ₂

NOTE : Ce protocole est établi pour induire la dégénérescence des cellules rétiniennes par injections intraoculaires de chlorure de cobalt (CoCl₂) chez les têtards de Xenopus laevis . Selon la dose, il peut déclencher une dégénérescence spécifique du cône ou une dégénérescence plus large¹⁴. Nous utilisons ce protocole chez les têtards de Xenopus laevis âgés à partir du stade 48. Il peut également être utilisé chez les têtards de Xenopus tropicalis .

1. Préparation du tampon et des réactifs
   1. Préparer une solution de benzocaïne à 0,005 % au moment de l’utilisation comme à l’étape 1.1.
   2. Préparer 100 mM de solution mère de CoCl₂ en ajoutant 118,5 mg à 5 mL de MBS 0,1x (voir l’étape 3.1.4 pour préparer 0,1x MBS). Conservez cette solution mère pendant plusieurs mois à 4 °C, à l’abri de la lumière avec une feuille d’aluminium.
      ATTENTION : Le CoCl₂ est classé comme un composé toxique pour la vie humaine et animale. Suivez attentivement les instructions de manipulation, de stockage et d’élimination des déchets figurant sur la fiche de données de sécurité.
   3. Pour la dégénérescence spécifique du cône, préparer une solution de CoCl₂ à 10 mM au moment de l’utilisation à partir de la solution mère à 100 mM diluée dans 0,1x MBS. Pour une dégénérescence plus large des cellules rétiniennes, préparez une solution de CoCl₂ à 25 mM.
2. Préparation du système d’injection
   1. Affûter les capillaires en verre à l’aide d’un extracteur de micropipette ¹³.
   2. Remplir un capillaire aiguisé avec 2 à 10 μL de solution de CoCl₂ à 10 ou 25 mM ou la solution de contrôle (0,1x MBS) à l’aide d’une pointe de microchargeur et placer le capillaire dans le manipulateur de micro-injecteurs.
   3. Au grossissement le plus élevé d’un stéréomicroscope, rompre l’extrémité capillaire à l’aide d’une pince fine et ajuster le temps d’injection (environ 100 ms) pour obtenir un volume d’éjection de 15 à 40 nL par impulsion. Réglez la pression d’éjection sur ~40 PSI.
      REMARQUE : La taille de la goutte doit être adaptée au stade des têtards et à la taille de leur œil. Par exemple, aux stades 48 et 49, la taille des gouttes est de ~15 à 20 nL, tandis qu’elle est de 30 à 40 nL aux stades 52 à 56. Visuellement, la taille de la goutte est un peu plus grande que la taille de l’objectif.
3. Injections intraoculaires de CoCl₂
   1. Utilisez une épuisette pour attraper les têtards dans leurs bassins. Transférez-les dans 50 mL de solution de benzocaïne à 0,005 %. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que les têtards cessent de réagir aux stimuli.
      REMARQUE : Plusieurs têtards peuvent être anesthésiés en même temps, mais le temps passé dans l’anesthésie doit être inférieur à 30 minutes.
   2. À l’aide d’une cuillère, attrapez un têtard et mettez-le soigneusement dans une petite boîte de Pétri (55 mm de diamètre) contenant un mouchoir humide. Placez le têtard, côté dorsal vers le haut, au milieu de la boîte de Pétri (Figure 1F,G).
   3. Utiliser le micro-injecteur sous stéréomicroscope pour injecter par voie intraoculaire la solution de CoCl₂ . Insérez doucement le capillaire dans l’œil par-dessus la lentille. Lorsque l’embout capillaire est à l’intérieur de l’œil, éjectez deux gouttes par œil. Après l’injection de l’œil droit, tournez manuellement la boîte de Pétri de 180° pour injecter l’œil gauche.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’injection est faite à l’intérieur de l’œil, de sorte qu’un léger gonflement de l’œil doit être vu après chaque éjection de la solution. Le têtard doit rester le moins possible hors de l’eau. L’injection des deux yeux devrait prendre moins de 1 min.
   4. Transvaser le têtard injecté dans un grand réservoir contenant 1 L d’eau d’élevage en l’immergeant soigneusement dans la boîte de Pétri (Figure 1H). Surveillez les têtards jusqu’à ce qu’ils soient complètement réveillés.

5. Coloration pour évaluer les lésions rétiniennes ou la dégénérescence rétinienne

1. Fixation des têtards et déshydratation
   1. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % en diluant 100 mL de solution de PFA à 32 % dans 700 mL de PBS 1x. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH. Aliquez cette solution mère et conservez-la plusieurs mois à -20 °C.
   2. Euthanasier les têtards dans de la benzocaïne à 0,01 % et les transférer dans un flacon contenant 4 % de PFA pendant 2 h à température ambiante avec agitation ou toute la nuit à 4 °C. Rincez 3 x 5 min dans 1x PBS.
   3. Déshydrater progressivement les têtards par incubations successives de 30 minutes dans de l’éthanol à 70 % et à 95 % (dilué dans de l’eau de type II), suivies de trois autres incubations de 1 h dans de l’éthanol à 100 %. Conservez les têtes de têtard à cette étape à -20 °C ou transférez-les directement sur du butanol à 100 % pendant la nuit pour les étapes suivantes.
2. Sectionnement de la paraffine
   1. Remplacer le butanol à 100 % par de la paraffine fondue pendant 2 h à 62 °C. Remplacer la paraffine pendant 2 x 2 h d’incubations supplémentaires à 62 °C.
   2. Transférez les têtes de têtard dans des moules jetables à enrobage de paraffine et orientez-les de manière à ce que leurs yeux soient bien alignés, puis laissez la paraffine durcir. Conservez les blocs à température ambiante.
   3. Coupez l’excédent de paraffine et montez le bloc avec le(s) têtard(s) intégré(s) sur le support du microtome.
   4. Sectionnez le bloc à l’aide d’un microtome à l’épaisseur appropriée (10-12 μm). Transférez les rubans avec des sections sur une lame préalablement recouverte d’albumine glycérine à 3 % (diluée dans de l’eau).
   5. Placez la lame sur un chauffe-lame à 42 °C pendant quelques minutes, puis retirez l’excès de glycérine albumine. Laissez sécher les lames pendant une nuit dans un four à 37 °C.
   6. Dépatisser en immergeant les lames pendant 2 x 15 min dans un bocal Coplin rempli à 100% de xylène. Réhydrater les sections avec des séries d’éthanol graduées : 100 % deux fois, 70 %, 50 % (diluées dans de l’eau de type II), ~5 min chacune, suivies de 2 x 5 min dans l’eau.
3. Marquage par immunofluorescence
   1. Préparer 100 mM de solution mère de citrate de sodium (CiNa) en ajoutant 29,4 g de sel trisodique de citrate de sodium dihydraté (C₆H₅Na₃O₇, 2H₂O) à 1 L d’eau de type II ; ajustez le pH à 6 avec de l’acide chlorhydrique (HCl). Stériliser à l’autoclavage et conserver à température ambiante pendant plusieurs mois. Préparer la solution de démasquage au moment de l’utilisation en ajoutant 25 mL de solution mère CiNa à 100 mM à 225 mL d’eau de type II. Ajouter 125 μL de Tween-20 et bien mélanger (la concentration finale est de 10 mM de CiNa, 0,05 % de Tween-20).
   2. Préparer la solution mère de Hoechst à 10 mg/mL en ajoutant 100 mg de bisbenzimide H 33258 à 10 mL d’eau de type I. Conservez cette solution mère pendant plusieurs mois à 4 °C, à l’abri de la lumière avec une feuille d’aluminium. Préparer la solution de Hoechst à 7,5 μg/mL en ajoutant 300 μL de solution mère de Hoechst à 400 mL de PBS 1x.
      REMARQUE : Cette solution peut être utilisée jusqu’à 10 fois et conservée pendant environ 6 mois à 4 °C, à l’abri de la lumière avec du papier d’aluminium.
   3. Après le déparaffinage des sections, effectuez la récupération de l’antigène en faisant bouillir les sections dans la solution de démasquage pendant 9 min. Laisser refroidir la solution pendant 20 min.
   4. Rincer une fois dans de l’eau de type II et une fois dans 1x PBS. Placez les lames à plat dans une chambre humide et ajoutez 400 à 600 μL de solution de blocage par lame (diluant d’anticorps + 0,2 % de Triton X100) pendant 30 min.
   5. Remplacer la solution bloquante par 200 μL par lame de l’anticorps primaire dilué dans la solution bloquante. Utilisez une lamelle pour étaler la solution sur les sections, en évitant la formation de bulles. Incuber une nuit à 4 °C dans une chambre humide.
   6. Transférez les lames dans un bocal Coplin et rincez-les pendant 3 x 10 min dans 1x PBS complété par 0,1 % de Triton X100. Mettez les lames à plat, ajoutez 400 μL par lame de l’anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage, et laissez reposer 2 h à température ambiante dans une chambre humide.
   7. Transférez les lames dans un bocal Coplin et rincez pendant 3 x 5 min avec 1x PBS complété par 0,1% de Triton X100.
   8. Contre-colorer les noyaux cellulaires avec la solution de Hoechst pendant 10 min et rincer 3 x 5 min avec 1x PBS.
   9. Placez les lamelles sur les lames dans un milieu de montage aqueux spécialement conçu pour préserver la fluorescence. Laissez sécher les lames pendant 1 h à température ambiante et conservez-les à 4 °C.
   10. Imagez les lames à l’aide d’un microscope à fluorescence.
4. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour évaluer les lésions rétiniennes
   REMARQUE : Au lieu de marquer un type de cellule particulier par immunomarquage, l’histologie rétinienne générale peut être évaluée avec une coloration H & E.
   1. Après le déparaffinage des sections, effectuer le marquage des acides nucléiques en immergeant les lames dans une solution d’hématoxyline pendant 2 min. Rincez abondamment à l’eau du robinet.
   2. Effectuer le marquage du cytoplasme en immergeant les lames dans une solution d’éosine à 1 % pendant 1 min. Rincez rapidement à l’eau.
      REMARQUE : L’éosine est très soluble ; Si les lames sont laissées trop longtemps dans l’eau, tout le colorant disparaît.
   3. Rincer 2 x 5 min dans de l’éthanol à 100 % et 2 x 5 min dans du xylène.
   4. Sous le capot, placez des lamelles sur les lames en 4 à 5 gouttes d’un support de montage. Laissez sécher les lames sous un capot et imagez-les le lendemain au microscope.
5. Détection de cellules apoptotiques
   1. Après les sections de déparaffinage (voir section 5.2.6), suivez le protocole du fabricant du kit pour détecter la fragmentation apoptotique de l’ADN.
   2. Effectuer la coloration des noyaux en immergeant les lames dans une solution de Hoechst (voir section 5.3.8) et les monter avec un milieu de montage aqueux spécialement conçu pour préserver la fluorescence. Laissez sécher les lames pendant 1 h à température ambiante et conservez-les à 4 °C.
   3. Imagez les lames à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Résultats

Lésion mécanique de la rétine
Des coupes rétiniennes de têtards soumis à la lésion mécanique décrite dans la section 1 du protocole montrent que la lésion rétinienne englobe toutes les couches du tissu tout en restant limitée au site de ponction (Figure 2A,B).

Ablation conditionnelle des cellules en bâtonnets à l’aide du système NTR-MTZ
Les yeux de têtards transgéniques Tg(rho :GFP-NT...

Discussion

Avantages et inconvénients de divers paradigmes de lésions rétiniennes chez les têtards de Xénope

Lésion mécanique de la rétine
Diverses lésions chirurgicales de la rétine neurale ont été développées chez les têtards de Xénope. La rétine neurale peut être soit entièrement enlevée 15,16, soit partiellement excisée ^16,17.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325