Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati Rappresentativi
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo sviluppato diversi protocolli per indurre danni o degenerazioni retiniche nei girini di Xenopus laevis . Questi modelli offrono la possibilità di studiare i meccanismi di rigenerazione retinica.

Abstract

Le malattie neurodegenerative della retina sono le principali cause di cecità. Tra le numerose strategie terapeutiche esplorate, l'autoriparazione stimolante è emersa recentemente come particolarmente attraente. Una fonte cellulare di interesse per la riparazione della retina è la cellula gliale di Müller, che ospita un potenziale di cellule staminali e una straordinaria capacità rigenerativa negli anamnioti. Questo potenziale è, tuttavia, molto limitato nei mammiferi. Lo studio dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione retinica in modelli animali con capacità rigenerative dovrebbe fornire informazioni su come sbloccare la capacità latente delle cellule di Müller dei mammiferi di rigenerare la retina. Si tratta di un passo fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa. A questo scopo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di danno retinico in Xenopus: una lesione retinica meccanica, una linea transgenica che consente l'ablazione condizionale dei fotorecettori mediata dalla nitroreduttasi, un modello di retinite pigmentosa basato sul knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 e un modello citotossico guidato da iniezioni intraoculari di CoCl2 . Evidenziandone i vantaggi e gli svantaggi, descriviamo qui questa serie di protocolli che generano varie condizioni degenerative e permettono lo studio della rigenerazione retinica in Xenopus.

Introduzione

Milioni di persone in tutto il mondo sono afflitte da varie malattie degenerative della retina che portano alla cecità, come la retinite pigmentosa, la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Ad oggi, queste condizioni rimangono in gran parte incurabili. Gli attuali approcci terapeutici in fase di valutazione includono la terapia genica, i trapianti di cellule o tessuti, i trattamenti neuroprotettivi, l'optogenetica e i dispositivi protesici. Un'altra strategia emergente si basa sull'auto-rigenerazione attraverso l'attivazione di cellule endogene con potenziale di cellule staminali. Le cellule gliali di Müller, il principale tipo di cel....

Protocollo

La cura degli animali e la sperimentazione sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali, nell'ambito della licenza istituzionale A91272108. I protocolli di studio sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura degli animali CEEA #59 e hanno ricevuto l'autorizzazione dalla Direction Départementale de la Protection des Populations con il numero di riferimento APAFIS #32589-2021072719047904 v4 e APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questi protocolli.

1. Lesione meccanica d....

Risultati Rappresentativi

Lesione meccanica della retina
Le sezioni retiniche dei girini sottoposti alla lesione meccanica descritta nella sezione 1 del protocollo mostrano che la lesione retinica comprende tutti gli strati del tessuto pur rimanendo limitata al sito di puntura (Figura 2A,B).

Ablazione condizionale delle cellule dei bastoncelli con il sistema NTR-MTZ
Gli occhi di girini transgenici Anestetizzati Tg(rho:GFP-NTR)

Discussione

Vantaggi e svantaggi dei vari paradigmi di lesione retinica nei girini di Xenopus

Lesione meccanica della retina
Varie lesioni chirurgiche della retina neurale sono state sviluppate nei girini di Xenopus. La retina neurale può essere completamente rimossa 15,16 o asportata solo parzialmente16,17. La lesione meccanica qui p.......

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni a M.P. da parte dell'Association Retina France, della Fondation de France, della FMR (Fondation Maladies Rares), della BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) e dell'UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in collaborazione con ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

....

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Propanediol (propylène glycol)Sigma-Aldrich398039
Absolute ethanol ≥99.8%VWR chemicals20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)Cell signaling9661SDilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)AveslabsGFP-1020Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5405Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11005Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)AbcamAb183951Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11008Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11012Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5585Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)Sigma-AldrichMABN15Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5407Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)PromegaG3250
Benzocaine Sigma-AldrichE1501Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%VWR chemicals20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Apparatus)30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab diluent AgilentS202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Electronic Rotary MicrotomeThermo ScientificMicrom HM 340E 
Eosin 1% aqueousRAL Diagnostics312740
Fluorescein lysine dextran  Invitrogen Thermo ScientificD1822
Fluorescent stereomicroscopeOlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
Glycerin albumin acc. MalloryDiapathE0012Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES potassium saltSigma-AldrichH0527
Human chorionic gonadotropin hormoneMSD Animal HealthChorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC7880Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazole Sigma-Aldrich (Supelco)M3761Use at 10 mM
Microloader tipsEppendorf5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.Model P-97Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave ReagentMillipore345789
Mounting medium, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome bladeEpredia3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µmSefar06-1000/44
Paraffin histowax without DMSOHistolab00403
Paraformaldehyde solution (32%)Electron Microscopy SciencesEM-15714-SUse at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsEpredia2219
PestleVWR431-0094
Petri Dish 100 mmCorning GosselinSB93-101
Petri Dish 55 mmCorning GosselinBP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer Microinjection systemParker Instrumentation ProductsPicoSpritzer III
Pins Fine Science Tools26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )Sigma-AldrichF4375Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Powdered fry food : sera Micron Naturesera45475 (00720)
Scissors dissectionFine Science Tools14090-09
Slide Superfrost  KNITTEL GlassVS11171076FKA 
Slide warmerKunz instrumentsHP-3
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)VWR chemicals27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich (Supelco)1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)VWR chemicals28217-292
StereomicroscopeZeissStemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mLB-BRAUN9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)Integrated DNA Technologies1072533
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC Fluorescence IlluminatorX-Cite 200DC
Xylene ≥98.5% VWR chemicals28975-325

Riferimenti

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. ....

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Modelli di lesioni retinichegirini di Xenopusmalattie neurodegenerative retinichececitautoriparazioneM 252 ller Glial CellPotenziale delle cellule staminaliCapacit rigenerativaMeccanismi molecolariModelli animaliM 252 nei mammiferi ller CellsRigenerazione della RetinaStrategie TerapeuticheMedicina RigenerativaParadigmi di Danno RetinicoDanno Meccanico RetinicoAblazione Condizionata Fotorecettore Mediata da NitroreduttasiModello di Retinite PigmentosaKnockout della Rodopsina mediata da CRISPR Cas9Modello CitotossicoIniezioni di CoCl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati