Generazione di modelli di lesioni retiniche nei girini di Xenopus

Riepilogo

Abbiamo sviluppato diversi protocolli per indurre danni o degenerazioni retiniche nei girini di Xenopus laevis . Questi modelli offrono la possibilità di studiare i meccanismi di rigenerazione retinica.

Abstract

Le malattie neurodegenerative della retina sono le principali cause di cecità. Tra le numerose strategie terapeutiche esplorate, l'autoriparazione stimolante è emersa recentemente come particolarmente attraente. Una fonte cellulare di interesse per la riparazione della retina è la cellula gliale di Müller, che ospita un potenziale di cellule staminali e una straordinaria capacità rigenerativa negli anamnioti. Questo potenziale è, tuttavia, molto limitato nei mammiferi. Lo studio dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione retinica in modelli animali con capacità rigenerative dovrebbe fornire informazioni su come sbloccare la capacità latente delle cellule di Müller dei mammiferi di rigenerare la retina. Si tratta di un passo fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa. A questo scopo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di danno retinico in Xenopus: una lesione retinica meccanica, una linea transgenica che consente l'ablazione condizionale dei fotorecettori mediata dalla nitroreduttasi, un modello di retinite pigmentosa basato sul knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 e un modello citotossico guidato da iniezioni intraoculari di CoCl₂ . Evidenziandone i vantaggi e gli svantaggi, descriviamo qui questa serie di protocolli che generano varie condizioni degenerative e permettono lo studio della rigenerazione retinica in Xenopus.

Introduzione

Milioni di persone in tutto il mondo sono afflitte da varie malattie degenerative della retina che portano alla cecità, come la retinite pigmentosa, la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Ad oggi, queste condizioni rimangono in gran parte incurabili. Gli attuali approcci terapeutici in fase di valutazione includono la terapia genica, i trapianti di cellule o tessuti, i trattamenti neuroprotettivi, l'optogenetica e i dispositivi protesici. Un'altra strategia emergente si basa sull'auto-rigenerazione attraverso l'attivazione di cellule endogene con potenziale di cellule staminali. Le cellule gliali di Müller, il principale tipo di cellule gliali della retina, sono tra le fonti cellulari di interesse in questo contesto. In caso di lesione, possono dedifferenziarsi, proliferare e generare neuroni ^1,2,3. Sebbene questo processo sia molto efficace nel pesce zebra o nello Xenopus, è in gran parte inefficiente nei mammiferi.

Ciononostante, è stato dimostrato che trattamenti appropriati con proteine mitogeniche o sovraespressione di vari fattori possono indurre il rientro del ciclo cellulare della glia di Müller nei mammiferi e, in alcuni casi, innescare il loro successivo impegno di neurogenesi 1,2,3,4,5. Questo rimane, tuttavia, largamente insufficiente per i trattamenti. Pertanto, è necessario aumentare la nostra conoscenza dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione per identificare molecole in grado di trasformare in modo efficiente le proprietà delle cellule staminali di Müller in nuove strategie terapeutiche cellulari.

Con questo obiettivo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di lesione in Xenopus che innescano la degenerazione delle cellule retiniche. Qui, presentiamo (1) una lesione retinica meccanica che non è specifica per il tipo di cellula, (2) un modello di ablazione cellulare condizionale e reversibile che utilizza il sistema NTR-MTZ che prende di mira le cellule dei bastoncelli, (3) un knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9, un modello di retinite pigmentosa che innesca la degenerazione progressiva delle cellule dei bastoncelli e (4) un CoCl₂-modello citotossico indotto che, a seconda della dose, può colpire in modo specifico i coni o portare a una più ampia degenerazione delle cellule retiniche. Evidenziamo le particolarità, i vantaggi e gli svantaggi di ciascun paradigma.

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Protocollo

La cura degli animali e la sperimentazione sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali, nell'ambito della licenza istituzionale A91272108. I protocolli di studio sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura degli animali CEEA #59 e hanno ricevuto l'autorizzazione dalla Direction Départementale de la Protection des Populations con il numero di riferimento APAFIS #32589-2021072719047904 v4 e APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questi protocolli.

1. Lesione meccanica della retina

NOTA: Il protocollo del paradigma di lesione qui descritto consiste in una puntura meccanica della retina di un girino dallo stadio 45 in poi. Pertanto, non prende di mira un particolare tipo di cellula retinica, ma danneggia l'intero spessore della retina nel sito di puntura.

1. Preparazione dell'anestetico per girini
   1. Preparare una soluzione madre al 10% di benzocaina. Per un volume totale di 10 ml, aggiungere 1 g di benzocaina, 2 mL di dimetilsolfossido (DMSO) e 8 mL di glicole propilenico. Conservare la soluzione madre per diversi mesi a 4 °C al riparo dalla luce con un foglio di alluminio.
   2. Preparare una soluzione di benzocaina allo 0,005% al momento dell'uso aggiungendo 25 μL di soluzione madre di benzocaina al 10% a 50 mL di acqua di allevamento girino (acqua di rubinetto filtrata e declorata). Mescolare bene.
      NOTA: La concentrazione di benzocaina è particolarmente bassa perché i girini sono altamente sensibili all'anestesia rispetto agli adulti.
2. Preparazione del perno
   1. Collegare un perno sterile di 0,2 mm di diametro a un portaperno sterilizzato (Figura 1A).
3. Anestesia girino
   1. Usa una rete da pesca per catturare i girini nelle loro vasche. Trasferirli in un nuovo serbatoio contenente la soluzione di benzocaina allo 0,005%. Attendere qualche minuto fino a quando i girini smettono di reagire agli stimoli (picchiettando la vasca o contatto diretto).
      NOTA: Diversi girini possono essere anestetizzati contemporaneamente, ma il tempo trascorso nella soluzione anestetica deve essere inferiore a 30 minuti.
4. Puntura della retina
   1. Usa un cucchiaio per catturare un girino e mettilo con cura su una piccola capsula di Petri (55 mm di diametro) contenente un fazzoletto bagnato. Posiziona il girino con il lato dorsale rivolto verso l'alto al centro della capsula di Petri.
   2. Sotto uno stereomicroscopio, perforare la retina inserendo delicatamente il perno sul lato dorsale dell'occhio, fino a quando non passa attraverso la retina (Figura 1A). Se sono necessari diversi colpi, ripetere questa procedura in punti diversi. Dopo aver perforato l'occhio destro, ruotare la capsula di Petri di 180° per perforare l'occhio sinistro.
   3. Trasferire il girino lesionato in una grande vasca contenente 1 L di acqua di allevamento immergendo con cura la capsula di Petri. Monitora i girini fino a quando non si sono completamente risvegliati.

2. Ablazione condizionale delle cellule a bastoncelli utilizzando il sistema NTR-MTZ

Il protocollo ha lo scopo di indurre l'ablazione specifica dei bastoncelli nella linea^{transgenica 6} di Xenopus Tg(rho:GFP-NTR), disponibile presso il servizio di zootecnia di TEFOR Paris-Saclay, che ospita il centro risorse francese Xenopus. Questo sistema chemiogenetico utilizza la capacità dell'enzima nitroreduttasi (NTR) di convertire il profarmaco metronidazolo (MTZ) in un agente reticolante del DNA citotossico, per ablare in modo specifico i bastoncelli che esprimono NTR (Figura 1B). In precedenza sono stati pubblicati due protocolli dettagliati per rendere transgenici gli animali Tg(rho:GFP-NTR) o Tg(rho:NTR) e indurre la degenerazione ^7,8. Qui, descriviamo semplicemente in dettaglio l'induzione della degenerazione retinica e come monitorare il processo di degenerazione in vivo.

1. Preparazione della soluzione di metronidazolo
   1. Preparare 10 mM di soluzione di MTZ al momento dell'uso sciogliendo 1,67 g di polvere di MTZ in un flacone scuro in 1 L di acqua di allevamento di girini contenente lo 0,1% di DMSO, utilizzando una barra di agitazione magnetica e un agitatore magnetico.
      NOTA: MTZ è sensibile alla luce. La dissoluzione completa può richiedere fino a 10 minuti.
2. Generazione di girini transgenici mediante accoppiamento naturale dalla linea Tg(rho:GFP-NTR)
   NOTA: Poiché i maschi transgenici rappresentano un ceppo prezioso, preferiamo generare embrioni tramite accoppiamento naturale per non sacrificare il maschio e usarlo ripetutamente.
   1. Somministrazione ormonale
      1. Iniettare 600 U.I. di ormone gonadotropina corionica umana (hCG) con aghi 25G nel sacco linfatico dorsale delle femmine wild-type di Xenopus laevis . Iniettare nei maschi transgenici 100-200 U.I. di hCG nel sacco linfatico dorsale. Per il monitoraggio in tempo reale della degenerazione dei bastoncelli (fase 2.4), utilizzare Xenopus albini piuttosto che quelli pigmentati, per visualizzare meglio le variazioni di fluorescenza attraverso l'occhio dei girini transgenici generati.
         NOTA: Le femmine di Xenopus possono essere adescate con 50 U.I. di hCG da 1 a 7 giorni prima dell'ovulazione programmata, ma questo è facoltativo.
   2. Accoppiamento e raccolta delle uova
      1. Subito dopo l'iniezione di hCG, mettere in una vasca un maschio transgenico Tg(rho:GFP-NTR) insieme a una femmina iniettata di hCG a 20 °C fino al giorno successivo. Utilizzare un volume grande (almeno 10 L) e aggiungere piccoli oggetti a cui far aderire le uova, in modo che le uova non vengano danneggiate dai movimenti degli adulti. Il giorno seguente, quando le rane non sono più in amplesso, prelevare gli adulti dalla vasca e raccogliere gli embrioni.
   3. Allevamento di embrioni e girini
      1. Stadio embrionali e girini secondo la normale tabella di sviluppo di Xenopus ⁹.
      2. Alleva gli embrioni in una vasca piena di acqua per l'allevamento dei girini. Dalla fase 45, nutri i girini con avannotti in polvere e ossigena l'acqua con un gorgogliatore. Aggiungere acqua ogni giorno, se necessario, per compensare l'evaporazione e cambiare settimanalmente l'acqua dell'intero serbatoio.
         NOTA: In alternativa, è anche possibile scambiare il 50% del volume due volte a settimana. Un protocollo dettagliato può essere trovato in¹⁰.
   4. Selezione di embrioni transgenici
      1. A partire dalla fase 37/38, ordinare e selezionare gli embrioni transgenici sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza visualizzando direttamente la GFP (Figura 1C).
3. Trattamento girino MTZ
   1. Trasferire girini transgenici Tg(rho:GFP-NTR) in una vasca contenente 10 mM di soluzione MTZ e allevarli a 20 °C al buio per 1 settimana. Utilizzare fratelli transgenici allevati in acqua di allevamento di girini contenente lo 0,1% di DMSO come controlli.
   2. Cambiare la soluzione MTZ e di controllo a giorni alterni durante il periodo di trattamento. Nutrire i girini come di consueto durante il trattamento MTZ.
   3. Per il monitoraggio individuale della fluorescenza (passaggio 2.4), posizionare ciascun girino nel suo piccolo contenitore con 30 mL di MTZ o soluzione di controllo dal passaggio 2.3.1 in poi.
      NOTA: Il trattamento MTZ può essere eseguito in qualsiasi momento dallo stadio 45 in poi.
4. Monitoraggio in tempo reale della degenerazione dei bastoncelli
   NOTA: La progressiva degenerazione delle aste può essere monitorata in tempo reale. Pertanto, eseguire i passaggi 2.4.1. al punto 2.4.4. prima del trattamento MTZ e poi regolarmente dopo il trattamento.
   1. Seguire i passaggi 1.1 e 1.3 rispettivamente per la preparazione dell'anestetico e dell'anestesia girino.
   2. Usa un cucchiaio per catturare un girino e mettilo con cura su un fazzoletto bagnato in una piccola capsula di Petri (55 mm di diametro). Osservare la fluorescenza GFP con uno stereomicroscopio fluorescente (lunghezza d'onda di eccitazione = 488 nm e lunghezza d'onda di emissione = 509 nm) e scattare fotografie dell'occhio. Una diminuzione dell'intensità della fluorescenza riflette la degradazione dei bastoncelli.
      NOTA: Per effettuare confronti quantitativi, è necessario mantenere le stesse impostazioni per l'imaging di tutti i girini.
   3. Trasferire il girino ripreso in una grande vasca contenente 1 L di acqua di allevamento immergendo con cura la capsula di Petri. Monitora i girini fino a quando non si sono completamente risvegliati.
   4. Confrontare l'intensità della fluorescenza tra gli occhi dei girini trattati con MTZ e quelli di controllo per monitorare e valutare l'efficacia del processo di degenerazione.

3. Degenerazione delle cellule dei bastoncelli mediante knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9

NOTA: Questo protocollo è stato stabilito per generare un modello di retinite pigmentosa in Xenopus laevis inducendo una specifica degenerazione delle cellule dei bastoncelli utilizzando il knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9. La % di inserzione-delezione (indel) in F0 è fornita in¹¹ ed è ~75%. Tale knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 può essere eseguito anche nei girini di Xenopus tropicalis ¹¹.

1. Preparazione di soluzioni e reagenti
   1. Ordinamento di crRNA e tracrRNA
      1. Acquista l'RNA sintetico CRISPR (crRNA) che ha come bersaglio il gene della rodopsina (rho) e il crRNA transattivante standard (tracrRNA). Il crRNA è composto da una regione rho target-specifica (GCUCUGCUAAAGUAAUACUGA) e da un'altra (GUUUUAGAGCUAUGCU) che si ibrida con il tracrRNA.
   2. crRNA: tracrRNA duplex (rho gRNA duplex)
      1. Risospendere crRNA e tracrRNA a 100 μM nel tampone duplex privo di nucleasi.
      2. Preparare il duplex di gRNA mescolando 3 μL di 100 μM di crRNA rho , 3 μL di 100 μM di tracrRNA e 94 μL di tampone duplex. Le concentrazioni finali sono 36 ng/μL rho crRNA e 67 ng/μL tracrRNA.
      3. Ricuocere gli oligo riscaldandoli a 95 °C per 5 minuti e raffreddarli lentamente a temperatura ambiente. Realizzare aliquote e conservarle a -20 °C.
   3. Complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 (i.e., gRNA duplex/proteina Cas9)
      1. Al momento dell'uso, preparare la miscela di rho gRNA duplex e la proteina Cas9. Per 20 μL, aggiungere 10 μL della soluzione duplex di gRNA rho , 2 μL di proteina Cas9 (stock a 5 mg/mL), 2 μL di destrano di lisina fluoresceina (stock a 10 mg/mL) e 6 μL di acqua priva di RNasi.
      2. Per formare il complesso ribonucleoproteico, incubare per 10 minuti a 37 °C e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.
      3. Per 20 μL della soluzione di controllo, miscelare 2 μL di proteina Cas9, 2 μL di destrano di lisina fluoresceina e 16 μL di acqua priva di RNasi.
   4. Preparazione di soluzioni MBS 10x, 1x e 0,1x
      1. Preparare la soluzione madre salina di Barth modificata (10x MBS) aggiungendo 11,92 g di HEPES, 51,43 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,75 g di cloruro di potassio (KCl), 2,1 g di bicarbonato di sodio (NaHCO₃) e 2,46 g di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO₄, 7 H₂O) in 800 ml di acqua di tipo II. Regolare il pH a 7,8 con idrossido di sodio (NaOH) al 30%. Aggiungere acqua di tipo II fino a quando il volume è di 1 L e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
      2. Preparare 1 L di 1x soluzione MBS diluendo 100 mL di soluzione salina 10x MBS e 7 mL di cloruro di calcio 0,1 M diidrato (CaCl 2, 2H₂ O) in acqua di tipo II. Conservare a temperatura ambiente.
      3. Preparare la soluzione 0,1x MBS diluendo 1x soluzione MBS in acqua di tipo II. Conservare a temperatura ambiente.
   5. Soluzione di benzocaina per adulti
      1. Preparare una soluzione di benzocaina allo 0,05% aggiungendo 5 ml di soluzione madre di benzocaina al 10% (vedere fase 1.1.1.) a 1 L di acqua per l'allevamento dei girini. Mescolare bene.
         NOTA: Conservare questa soluzione per diversi mesi a 4 °C al riparo dalla luce con un foglio di alluminio. Portare la soluzione a temperatura ambiente prima di utilizzarla sugli animali.
   6. Soluzione di L-cisteina
      1. Preparare la soluzione degelatinante al momento dell'uso aggiungendo 2 g di L-cisteina cloridrico monoidrato a 100 mL di soluzione 0,1x MBS. Regolare il pH a 7,8 con il 30% di NaOH.
   7. Soluzione di polisaccarosio
      1. Preparare la soluzione densa di polisaccarosio aggiungendo 3 g di polisaccarosio a 100 mL di soluzione 0,1x MBS. Conservare questa soluzione per alcune settimane a 4 °C.
2. Fecondazione in vitro e dejellying
   NOTA: Maggiori dettagli sulla fecondazione in vitro di Xenopus possono essere trovati in un protocollo dedicato dettagliato in¹².
   1. Somministrazione di ormoni alle femmine di Xenopus laevis per indurre l'ovulazione
      1. Circa 15 ore prima del prelievo degli ovociti, iniettare 600 U.I. di hCG nel sacco linfatico dorsale della femmina e tenerlo per una notte a 18 °C.
   2. Dissezione del testicolo
      1. Sopprimere il maschio di Xenopus con una dose letale di soluzione di benzocaina allo 0,05% per 10-15 minuti. Come metodo di eutanasia complementare, recidere la colonna vertebrale immediatamente posteriore al cranio con forbici affilate e robuste. Apri la cavità addominale con le forbici da dissezione, taglia i testicoli e taglia via il grasso e i capillari attaccati. Mettere immediatamente ogni testicolo sul ghiaccio in 1 ml di 1x MBS.
   3. Preparazione dello sperma
      1. Frantumare un testicolo utilizzando un pestello per provette da microcentrifuga e diluire la sospensione in una provetta da 15 mL contenente 9 mL di 1x MBS. Aggiungere 10 μg/mL di gentamicina alla seconda provetta testicolare e mantenerla a 4 °C per alcuni giorni per ulteriori esperimenti di fecondazione.
   4. Fecondazione in vitro
      1. Massaggiare delicatamente il dorso della femmina a cui è stato iniettato l'ormone e raccogliere gli ovociti in una capsula di Petri (100 mm di diametro). Distribuire alcune gocce della soluzione di sperma sugli ovociti. Attendi 5 minuti e coprili con 0,1x MBS. Attendere 10 minuti prima di procedere con la degelatinizzazione.
   5. Dejellying degli ovuli fecondati
      1. Sostituire la soluzione 0,1x MBS con la soluzione degelatinante per rimuovere il rivestimento gelatinoso dalle uova fecondate (~5 min). Sciacquare accuratamente gli embrioni 5-6 volte con MBS 0,1x e trasferirli in una nuova capsula di Petri da 100 mm riempita con MBS 0,1x.
3. Preparazione del sistema di microiniezione
   1. Affilare i capillari di vetro con un estrattore per micropipette¹³.
   2. Riempire un capillare affilato con 2-10 μL di complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 o la soluzione di controllo utilizzando una punta del microcaricatore e posizionare il capillare nel manipolatore del microiniettore.
   3. All'ingrandimento più alto di uno stereomicroscopio, rompere la punta capillare con una pinza fine e regolare il tempo di iniezione (~400 ms) per ottenere un volume di eiezione di 10 nL per impulso. Impostare la pressione di espulsione a circa 40 PSI.
4. Microiniezione embrionale in fase unicellulare con il complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9
   1. Posizionare gli embrioni allo stadio di una cellula su una griglia (tessuto di nylon da 1 mm) incollata in una capsula di Petri da 100 mm riempita con una soluzione di polisaccarosio al 3% (Figura 1D).
   2. Utilizzando il microiniettore e sotto uno stereomicroscopio, iniettare 10 nL del complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 (che corrisponde a 500 pg di gRNA duplex + 5 ng di proteina Cas9 per embrione) o soluzione di controllo a livello del polo animale, nella regione corticale, appena sotto la membrana citoplasmatica.
      NOTA: Il destrano di lisina fluoresceina contenuto nella soluzione consente la successiva cernita degli embrioni iniettati.
   3. Trasferire gli embrioni iniettati in una nuova capsula di Petri da 100 mm contenente una soluzione di polisaccarosio pulita e posizionarli a 21 °C.
   4. Il primo giorno, selezionare regolarmente gli embrioni ben sviluppati e sostituire la soluzione di polisaccarosio con 0,1x MBS circa 5 ore dopo la microiniezione.
   5. Attendere 24 ore dopo l'iniezione per selezionare e selezionare gli embrioni rho crispant ben iniettati con uno stereomicroscopio a fluorescenza visualizzando il destrano di lisina fluoresceina (Figura 1E).
      NOTA: Prima è la microiniezione dopo la fecondazione, più efficace è il knockout.
5. Allevamento di embrioni e girini
   1. Allevare embrioni rho crispant in 0,1x MBS in piastre di Petri fino allo stadio 37/38. Rimuovere gli embrioni morti ogni giorno e cambiare la soluzione MBS 0,1x. Dalla fase 37/38, allevare gli embrioni in una vasca riempita con acqua per l'allevamento dei girini e dalla fase 45 procedere come nella fase 2.2.3.

4. Degenerazione delle cellule retiniche mediante iniezioni intraoculari citotossiche di CoCl ₂

NOTA: Questo protocollo è stabilito per indurre la degenerazione delle cellule retiniche mediante iniezioni intraoculari di cloruro di cobalto (CoCl₂) nei girini di Xenopus laevis . A seconda della dose, può innescare una degenerazione specifica del cono o una degenerazione più ampia¹⁴. Utilizziamo questo protocollo nei girini di Xenopus laevis di età compresa tra i 48 e gli anni in poi. Può essere utilizzato anche nei girini di Xenopus tropicalis .

1. Preparazione del tampone e dei reagenti
   1. Preparare una soluzione di benzocaina allo 0,005% al momento dell'uso come al punto 1.1.
   2. Preparare 100 mM di soluzione madre di CoCl₂ aggiungendo 118,5 mg a 5 mL di 0,1x MBS (vedere il passaggio 3.1.4 per preparare 0,1x MBS). Conservare questa soluzione madre per diversi mesi a 4 °C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio.
      ATTENZIONE: CoCl₂ è classificato come composto tossico per la vita umana e animale. Seguire scrupolosamente le istruzioni per la manipolazione, lo stoccaggio e lo smaltimento dei rifiuti riportate nella scheda di sicurezza.
   3. Per la degenerazione specifica del cono, preparare una soluzione di CoCl₂ da 10 mM al momento dell'uso dalla soluzione madre da 100 mM diluita in MBS 0,1x. Per una più ampia degenerazione delle cellule retiniche, preparare una soluzione di CoCl₂ 25 mM.
2. Preparazione del sistema di iniezione
   1. Affilare i capillari di vetro con un estrattore per micropipette ¹³.
   2. Riempire un capillare affilato con 2-10 μL di soluzione di CoCl₂ da 10 o 25 mM o la soluzione di controllo (0,1x MBS) utilizzando una punta del microcaricatore e posizionare il capillare nel manipolatore del microiniettore.
   3. All'ingrandimento più alto di uno stereomicroscopio, rompere la punta capillare con una pinza fine e regolare il tempo di iniezione (circa 100 ms) per ottenere un volume di espulsione di 15-40 nL per impulso. Impostare la pressione di espulsione su ~40 PSI.
      NOTA: La dimensione della goccia deve essere adattata allo stadio dei girini e alle dimensioni del loro occhio. Ad esempio, nelle fasi 48-49, la dimensione della goccia è ~15-20 nL, mentre è 30-40 nL nelle fasi 52-56. Visivamente, la dimensione della goccia è un po' più grande della dimensione dell'obiettivo.
3. Iniezioni intraoculari di CoCl₂
   1. Usa una rete da pesca per catturare i girini nelle loro vasche. Trasferirli in 50 mL di soluzione di benzocaina allo 0,005%. Attendi qualche minuto fino a quando i girini smettono di reagire agli stimoli.
      NOTA: Diversi girini possono essere anestetizzati contemporaneamente, ma il tempo trascorso nell'anestetico deve essere inferiore a 30 minuti.
   2. Usa un cucchiaio per catturare un girino e mettilo con cura in una piccola capsula di Petri (55 mm di diametro) contenente un fazzoletto bagnato. Posizionare il girino con il lato dorsale rivolto verso l'alto al centro della capsula di Petri (Figura 1F,G).
   3. Utilizzare il microiniettore sotto uno stereomicroscopio per iniettare intraocularmente la soluzione di CoCl₂ . Inserire delicatamente il capillare nell'occhio sopra la lente. Quando la punta capillare è all'interno dell'occhio, espellere due gocce per occhio. Dopo aver iniettato l'occhio destro, ruotare manualmente la capsula di Petri di 180° per iniettare l'occhio sinistro.
      NOTA: Assicurarsi che l'iniezione venga eseguita all'interno dell'occhio, in modo da notare un leggero gonfiore dell'occhio dopo ogni espulsione della soluzione. Il girino dovrebbe stare fuori dall'acqua il meno possibile. L'iniezione di entrambi gli occhi deve richiedere meno di 1 minuto.
   4. Trasferire il girino iniettato in una grande vasca contenente 1 L di acqua di allevamento immergendolo con cura nella capsula di Petri (Figura 1H). Monitora i girini fino a quando non si sono completamente risvegliati.

5. Colorazione per valutare il danno retinico o la degenerazione retinica

1. Fissazione e disidratazione del girino
   1. Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% diluendo 100 mL di soluzione di PFA al 32% in 700 mL di PBS 1x. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Aliquotare questa soluzione madre e conservarla per diversi mesi a -20 °C.
   2. Eutanasia i girini in benzocaina allo 0,01% e trasferirli in una fiala contenente PFA al 4% per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione o per una notte a 4 °C. Risciacquare 3 x 5 min in 1x PBS.
   3. Disidratare progressivamente i girini mediante successive incubazioni di 30 minuti in etanolo al 70% e al 95% (diluito in acqua di tipo II), seguite da altre tre incubazioni di 1 ora in etanolo al 100%. Conservare le teste dei girini in questa fase a -20 °C o trasferirle direttamente al butanolo al 100% durante la notte per ulteriori passaggi.
2. Sezionamento della paraffina
   1. Sostituire il butanolo al 100% con paraffina fusa per 2 ore a 62 °C. Sostituire la paraffina per 2 x 2 ore di incubazione supplementare a 62 °C.
   2. Trasferisci le teste dei girini in stampi usa e getta per inclusione di paraffina e orientali in modo che i loro occhi siano ben allineati, quindi lascia che la paraffina si indurisca. Conservare i blocchi a temperatura ambiente.
   3. Tagliare la paraffina in eccesso e montare il blocco con il/i girino/i incorporato/i sul supporto del microtomo.
   4. Sezionare il blocco con un microtomo allo spessore appropriato (10-12 μm). Trasferire i nastri con le sezioni su un vetrino precedentemente ricoperto con glicerina albumina al 3% (diluita in acqua).
   5. Posizionare il vetrino su uno scaldavetrini a 42 °C per alcuni minuti e poi rimuovere l'eccesso di glicerina albumina. Lasciare asciugare i vetrini per una notte in forno a 37 °C.
   6. Decerare immergendo i vetrini per 2 x 15 minuti in un barattolo Coplin riempito al 100% di xilene. Reidratare le sezioni con una serie di etanolo graduato: 100% due volte, 70%, 50% (diluito in acqua di tipo II), ~5 minuti ciascuna, seguito da 2 x 5 minuti in acqua.
3. Marcatura a immunofluorescenza
   1. Preparare 100 mM di soluzione madre di citrato di sodio (CiNa) aggiungendo 29,4 g di citrato di sodio sale trisodico diidrato (C₆H₅Na₃O₇, 2H₂O) a 1 L di acqua di tipo II; regolare il pH a 6 con acido cloridrico (HCl). Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente per diversi mesi. Preparare la soluzione di smascheramento al momento dell'uso aggiungendo 25 mL di soluzione madre CiNa 100 mM a 225 mL di acqua di tipo II. Aggiungere 125 μL di Tween-20 e mescolare bene (la concentrazione finale è 10 mM CiNa, 0,05% Tween-20).
   2. Preparare la soluzione madre Hoechst a 10 mg/mL aggiungendo 100 mg di bisBenzimide H 33258 a 10 mL di acqua di tipo I. Conservare questa soluzione madre per diversi mesi a 4 °C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio. Preparare la soluzione di Hoechst a 7,5 μg/mL aggiungendo 300 μL di soluzione madre di Hoechst a 400 mL di 1x PBS.
      NOTA: Questa soluzione può essere utilizzata fino a 10 volte e conservata per circa 6 mesi a 4 °C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio.
   3. Dopo aver depato le sezioni, eseguire il recupero dell'antigene facendo bollire le sezioni nella soluzione di smascheramento per 9 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione per 20 min.
   4. Risciacquare una volta in acqua di tipo II e una volta in 1x PBS. Mettere i vetrini in una camera umida e aggiungere 400-600 μL di soluzione bloccante per vetrino (diluente anticorpale + 0,2% Triton X100) per 30 minuti.
   5. Sostituire la soluzione bloccante con 200 μL per vetrino dell'anticorpo primario diluito nella soluzione bloccante. Utilizzare un vetrino coprioggetto per distribuire la soluzione sulle sezioni, evitando la formazione di bolle. Incubare per una notte a 4 °C in camera umida.
   6. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin e risciacquare per 3 x 10 minuti in 1x PBS integrato con Triton X100 allo 0,1%. Mettere i vetrini in piano, aggiungere 400 μL per vetrino dell'anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante e lasciare agire per 2 ore a temperatura ambiente in una camera umida.
   7. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin e risciacquare per 3 x 5 minuti con 1x PBS integrato con Triton X100 allo 0,1%.
   8. Controcolorare i nuclei cellulari con la soluzione Hoechst per 10 minuti e risciacquare 3 x 5 minuti con 1x PBS.
   9. Posizionare i vetrini coprioggetti sui vetrini in un mezzo di montaggio acquoso specificamente progettato per preservare la fluorescenza. Lasciare asciugare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente e conservarli a 4 °C.
   10. Visualizzare i vetrini con un microscopio a fluorescenza.
4. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) per valutare il danno retinico
   NOTA: Invece di marcare un particolare tipo di cellula mediante immunocolorazione, l'istologia retinica generale può essere valutata con la colorazione H&E.
   1. Dopo la deceratura delle sezioni, eseguire la marcatura degli acidi nucleici immergendo i vetrini in una soluzione di ematossilina per 2 minuti. Risciacquare bene con acqua di rubinetto.
   2. Eseguire la marcatura del citoplasma immergendo i vetrini in una soluzione di eosina all'1% per 1 minuto. Risciacquare velocemente con acqua.
      NOTA: L'eosina è molto solubile; Se i vetrini vengono lasciati troppo a lungo nell'acqua, tutto il colorante scompare.
   3. Risciacquare 2 x 5 min in etanolo al 100% e 2 x 5 min in xilene.
   4. Sotto il cofano, posizionare i vetrini coprioggetti sui vetrini in 4-5 gocce di un mezzo di montaggio. Lasciare asciugare i vetrini sotto una cappa e fotografarli il giorno seguente con un microscopio.
5. Rilevamento di cellule apoptotiche
   1. Dopo le sezioni di deceratura (vedere paragrafo 5.2.6), seguire il protocollo del produttore del kit per rilevare la frammentazione del DNA apoptotico.
   2. Eseguire la colorazione dei nuclei immergendo i vetrini nella soluzione di Hoechst (vedere paragrafo 5.3.8) e montarli con un mezzo di montaggio acquoso specificamente progettato per preservare la fluorescenza. Lasciare asciugare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente e conservarli a 4 °C.
   3. Visualizzare i vetrini con un microscopio a fluorescenza.

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Risultati

Lesione meccanica della retina
Le sezioni retiniche dei girini sottoposti alla lesione meccanica descritta nella sezione 1 del protocollo mostrano che la lesione retinica comprende tutti gli strati del tessuto pur rimanendo limitata al sito di puntura (Figura 2A,B).

Ablazione condizionale delle cellule dei bastoncelli con il sistema NTR-MTZ
Gli occhi di girini transgenici Anestetizzati Tg(rho:GFP-NTR)

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Discussione

Vantaggi e svantaggi dei vari paradigmi di lesione retinica nei girini di Xenopus

Lesione meccanica della retina
Varie lesioni chirurgiche della retina neurale sono state sviluppate nei girini di Xenopus. La retina neurale può essere completamente rimossa 15,16 o asportata solo parzialmente^16,17. La lesione meccanica qui p...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325