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* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Wir haben mehrere Protokolle entwickelt, um Netzhautschäden oder Netzhautdegeneration bei Xenopus laevis-Kaulquappen zu induzieren. Diese Modelle bieten die Möglichkeit, die Regenerationsmechanismen der Netzhaut zu untersuchen.
Neurodegenerative Netzhauterkrankungen sind die Hauptursachen für Erblindung. Unter den zahlreichen therapeutischen Strategien, die erforscht werden, hat sich in jüngster Zeit die Stimulierung der Selbstreparatur als besonders attraktiv erwiesen. Eine zelluläre Quelle von Interesse für die Netzhautreparatur ist die Müller-Gliazelle, die Stammzellpotenzial und eine außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit in Anamnioten birgt. Dieses Potenzial ist jedoch bei Säugetieren sehr begrenzt. Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Netzhautregeneration in Tiermodellen mit regenerativen Fähigkeiten zugrunde liegen, soll Aufschluss darüber geben, wie die latente Fähigkeit von Säugetier-Müller-Zellen zur Regeneration der Netzhaut freigesetzt werden kann. Dies ist ein wichtiger Schritt für die Entwicklung therapeutischer Strategien in der regenerativen Medizin. Zu diesem Zweck haben wir mehrere Paradigmen für Netzhautverletzungen in Xenopus entwickelt: eine mechanische Netzhautverletzung, eine transgene Linie, die eine bedingte Ablation von Nitroreduktase-vermittelten Photorezeptoren ermöglicht, ein Retinitis pigmentosa-Modell, das auf einem CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout basiert, und ein zytotoxisches Modell, das durch intraokulare CoCl2-Injektionen gesteuert wird. Unter Hervorhebung ihrer Vor- und Nachteile beschreiben wir hier diese Reihe von Protokollen, die verschiedene degenerative Zustände hervorrufen und die Untersuchung der Netzhautregeneration bei Xenopus ermöglichen.
Millionen von Menschen weltweit leiden an verschiedenen degenerativen Netzhauterkrankungen, die zur Erblindung führen, wie z. B. Retinitis pigmentosa, diabetische Retinopathie oder altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Bis heute sind diese Erkrankungen weitgehend unbehandelbar. Zu den derzeit untersuchten therapeutischen Ansätzen gehören Gentherapie, Zell- oder Gewebetransplantationen, neuroprotektive Behandlungen, Optogenetik und Prothesen. Eine weitere neue Strategie basiert auf der Selbstregeneration durch die Aktivierung körpereigener Zellen mit Stammzellpotenzial. Müller-Gliazellen, der wichtigste Gliazelltyp der Netzhaut, gehören zu den zellulären Quellen von Interesse in diesem Zusammenhang. Bei Verletzungen können sie dedifferenzieren, sich vermehren und Neuronen erzeugen 1,2,3. Obwohl dieser Prozess bei Zebrafischen oder Xenopus sehr effektiv ist, ist er bei Säugetieren weitgehend ineffizient.
Nichtsdestotrotz konnte gezeigt werden, dass geeignete Behandlungen mit mitogenen Proteinen oder die Überexpression verschiedener Faktoren den Wiedereintritt in den Zyklus der Müllergliazellen von Säugetieren induzieren und in einigen Fällen deren anschließende Neurogeneseverpflichtung auslösen können 1,2,3,4,5. Für die Behandlung ist dies jedoch nach wie vor weitgehend unzureichend. Daher ist es notwendig, unser Wissen über die molekularen Mechanismen, die der Regeneration zugrunde liegen, zu erweitern, um Moleküle zu identifizieren, die in der Lage sind, die Eigenschaften von Müller-Stammzellen effizient in neue zelluläre therapeutische Strategien umzuwandeln.
Zu diesem Zweck haben wir mehrere Verletzungsparadigmen in Xenopus entwickelt, die die Degeneration von Netzhautzellen auslösen. Hier präsentieren wir (1) eine mechanische Netzhautverletzung, die nicht zelltypspezifisch ist, (2) ein konditionelles und reversibles Zellablationsmodell mit dem NTR-MTZ-System, das auf Stäbchenzellen abzielt, (3) einen CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout , ein Modell der Retinitis pigmentosa, das eine progressive Stäbchenzelldegeneration auslöst, und (4) ein CoCl2-induziertes zytotoxisches Modell, das je nach Dosis spezifisch auf Zapfen abzielen oder zu einer breiteren Degeneration von Netzhautzellen führen kann. Wir beleuchten die Besonderheiten, Vor- und Nachteile der einzelnen Paradigmen.
Die Tierpflege und die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien unter der institutionellen Lizenz A91272108 durchgeführt. Die Studienprotokolle wurden vom institutionellen Tierpflegeausschuss CEEA #59 genehmigt und von der Direction Départementale de la Protection des Populations unter der Referenznummer APAFIS #32589-2021072719047904 v4 und APAFIS #21474-2019071210549691 v2 genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesen Protokollen verwendet werden.
1. Mechanische Netzhautverletzung
ANMERKUNG: Das hier beschriebene Verletzungsparadigma-Protokoll besteht aus einer mechanischen Netzhautpunktion einer Kaulquappe ab Stadium 45. Es zielt also nicht auf einen bestimmten Netzhautzelltyp ab, sondern schädigt die gesamte Dicke der Netzhaut an der Einstichstelle.
2. Bedingte Stäbchenzellablation mit dem NTR-MTZ-System
Das Protokoll zielt darauf ab, eine spezifische Stäbchenzellablation in der transgenen Xenopus-Tg(rho:GFP-NTR)-Linie6 zu induzieren, die im Tierzuchtdienst der TEFOR Paris-Saclay erhältlich ist, der das französische Xenopus-Ressourcenzentrum beherbergt. Dieses chemogenetische System nutzt die Fähigkeit des Enzyms Nitroreduktase (NTR), das Prodrug Metronidazol (MTZ) in ein zytotoxisches DNA-Vernetzungsmittel umzuwandeln, um NTR-exprimierende Stäbchen spezifisch abzutragen (Abbildung 1B). Zwei detaillierte Protokolle zur Herstellung von Tg(rho:GFP-NTR)- oder Tg(rho:NTR)-transgenen Tieren und zur Induktion von Degeneration wurden bereits veröffentlicht 7,8. Hier beschreiben wir einfach die Induktion der Netzhautdegeneration und wie man den Degenerationsprozess in vivo überwacht.
3. Stäbchenzelldegeneration durch CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um ein Modell der Retinitis pigmentosa in Xenopus laevis zu generieren, indem eine spezifische Stäbchenzelldegeneration mittels CRISPR/Cas9-vermitteltem Rhodopsin-Knockout induziert wird. Der Prozentsatz der Einfüge-Deletion (Indels) in F0 ist in11 angegeben und beträgt ~75%. Ein solcher CRISPR/Cas9-vermittelter Rhodopsin-Knockout kann auch bei Kaulquappen von Xenopus tropicalis durchgeführt werden 11.
4. Retinale Zelldegeneration durch zytotoxische intraokulare CoCl 2-Injektionen
ANMERKUNG: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Degeneration von Netzhautzellen durch intraokulare Injektionen von Kobaltchlorid (CoCl2) bei Kaulquappen von Xenopus laevis zu induzieren. Je nach Dosis kann es eine zapfenspezifische Degeneration oder eine breitere Degeneration auslösen14. Wir verwenden dieses Protokoll bei Kaulquappen von Xenopus laevis ab dem Stadium 48. Es kann auch bei Kaulquappen von Xenopus tropicalis verwendet werden.
5. Färbung zur Beurteilung von Netzhautschäden oder Netzhautdegeneration
Mechanische Netzhautverletzung
Netzhautschnitte von Kaulquappen, die der in Protokollabschnitt 1 beschriebenen mechanischen Verletzung ausgesetzt waren, zeigen, dass die Netzhautläsion alle Schichten des Gewebes umfasst, während sie auf die Punktionsstelle beschränkt bleibt (Abbildung 2A,B).
Bedingte Stäbchenzellablation mit dem NTR-MTZ-System
Die Augen von anästhesierten Tg(rho:GFP-NTR)-transg...
Vor- und Nachteile verschiedener Netzhautverletzungsparadigmen bei Xenopus-Kaulquappen
Mechanische Netzhautverletzung
Bei Xenopus-Kaulquappen haben sich verschiedene chirurgische Verletzungen der neuralen Netzhaut entwickelt. Die neurale Netzhaut kann entweder vollständig entfernt werden 15,16 oder nur teilweise entfernt werden16,17.
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Diese Forschung wurde durch Stipendien an M.P. von der Association Retina France, der Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) und UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in Zusammenarbeit mit ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0) |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
Pestle | VWR | 431-0094 | |
Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
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