Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

Zusammenfassung

Wir haben mehrere Protokolle entwickelt, um Netzhautschäden oder Netzhautdegeneration bei Xenopus laevis-Kaulquappen zu induzieren. Diese Modelle bieten die Möglichkeit, die Regenerationsmechanismen der Netzhaut zu untersuchen.

Zusammenfassung

Neurodegenerative Netzhauterkrankungen sind die Hauptursachen für Erblindung. Unter den zahlreichen therapeutischen Strategien, die erforscht werden, hat sich in jüngster Zeit die Stimulierung der Selbstreparatur als besonders attraktiv erwiesen. Eine zelluläre Quelle von Interesse für die Netzhautreparatur ist die Müller-Gliazelle, die Stammzellpotenzial und eine außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit in Anamnioten birgt. Dieses Potenzial ist jedoch bei Säugetieren sehr begrenzt. Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Netzhautregeneration in Tiermodellen mit regenerativen Fähigkeiten zugrunde liegen, soll Aufschluss darüber geben, wie die latente Fähigkeit von Säugetier-Müller-Zellen zur Regeneration der Netzhaut freigesetzt werden kann. Dies ist ein wichtiger Schritt für die Entwicklung therapeutischer Strategien in der regenerativen Medizin. Zu diesem Zweck haben wir mehrere Paradigmen für Netzhautverletzungen in Xenopus entwickelt: eine mechanische Netzhautverletzung, eine transgene Linie, die eine bedingte Ablation von Nitroreduktase-vermittelten Photorezeptoren ermöglicht, ein Retinitis pigmentosa-Modell, das auf einem CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout basiert, und ein zytotoxisches Modell, das durch intraokulare CoCl_{2-Injektionen} gesteuert wird. Unter Hervorhebung ihrer Vor- und Nachteile beschreiben wir hier diese Reihe von Protokollen, die verschiedene degenerative Zustände hervorrufen und die Untersuchung der Netzhautregeneration bei Xenopus ermöglichen.

Einleitung

Millionen von Menschen weltweit leiden an verschiedenen degenerativen Netzhauterkrankungen, die zur Erblindung führen, wie z. B. Retinitis pigmentosa, diabetische Retinopathie oder altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Bis heute sind diese Erkrankungen weitgehend unbehandelbar. Zu den derzeit untersuchten therapeutischen Ansätzen gehören Gentherapie, Zell- oder Gewebetransplantationen, neuroprotektive Behandlungen, Optogenetik und Prothesen. Eine weitere neue Strategie basiert auf der Selbstregeneration durch die Aktivierung körpereigener Zellen mit Stammzellpotenzial. Müller-Gliazellen, der wichtigste Gliazelltyp der Netzhaut, gehören zu den zellulären Quellen von....

Protokoll

Die Tierpflege und die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien unter der institutionellen Lizenz A91272108 durchgeführt. Die Studienprotokolle wurden vom institutionellen Tierpflegeausschuss CEEA #59 genehmigt und von der Direction Départementale de la Protection des Populations unter der Referenznummer APAFIS #32589-2021072719047904 v4 und APAFIS #21474-2019071210549691 v2 genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesen Protokollen verwendet werden.

1. Mechanische Netzhautverletzung

Ergebnisse

Mechanische Netzhautverletzung
Netzhautschnitte von Kaulquappen, die der in Protokollabschnitt 1 beschriebenen mechanischen Verletzung ausgesetzt waren, zeigen, dass die Netzhautläsion alle Schichten des Gewebes umfasst, während sie auf die Punktionsstelle beschränkt bleibt (Abbildung 2A,B).

Bedingte Stäbchenzellablation mit dem NTR-MTZ-System
Die Augen von anästhesierten Tg(rho:GFP-NTR)-transg.......

Diskussion

Vor- und Nachteile verschiedener Netzhautverletzungsparadigmen bei Xenopus-Kaulquappen

Mechanische Netzhautverletzung
Bei Xenopus-Kaulquappen haben sich verschiedene chirurgische Verletzungen der neuralen Netzhaut entwickelt. Die neurale Netzhaut kann entweder vollständig entfernt werden 15,16 oder nur teilweise entfernt werden^16,17.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325