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本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

我们已经开发了几种方案来诱导 非洲爪 蟾蝌蚪的视网膜损伤或视网膜变性。这些模型为研究视网膜再生机制提供了可能性。

摘要

视网膜神经退行性疾病是导致失明的主要原因。在正在探索的众多治疗策略中，刺激自我修复最近显得特别有吸引力。Müller神经胶质细胞是视网膜修复的一个感兴趣的细胞来源，它具有干细胞的潜力和非凡的再生能力。然而，这种潜力在哺乳动物中非常有限。在具有再生能力的动物模型中研究视网膜再生的分子机制应该有助于了解如何释放哺乳动物Müller细胞再生视网膜的潜在能力。这是再生医学治疗策略发展的关键一步。为此，我们在 非洲爪蟾中开发了几种视网膜损伤范式：机械性视网膜损伤、允许硝基还原酶介导的光感受器条件消融的转基因系、基于 CRISPR/Cas9 介导的视紫 红质 敲除的视网膜色素变性模型，以及由眼内注射 CoCl2 驱动的细胞毒性模型。为了强调它们的优点和缺点，我们在这里描述了这一系列的方案，这些方案会产生各种退行性条件，并允许研究 非洲爪蟾的视网膜再生。

引言

全世界有数百万人患有各种导致失明的视网膜退行性疾病，例如视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变或年龄相关性黄斑变性 （AMD）。迄今为止，这些疾病在很大程度上仍然无法治愈。目前正在评估的治疗方法包括基因治疗、细胞或组织移植、神经保护治疗、光遗传学和假肢装置。另一种新兴策略是基于通过激活具有干细胞潜力的内源性细胞进行自我再生。Müller 神经胶质细胞是视网膜的主要神经胶质细胞类型，是在这种情况下感兴趣的细胞来源之一。受伤后，它们可以去分化、增殖并产生神经元 1,2,3。虽然这个过程在斑马鱼或非洲爪蟾中非常有效，但在哺乳动物中却在很大程度上是低效的。

尽管如此，已经表明，用有丝分裂蛋白进行适当的治疗或各种因子的过表达可以诱导哺乳动物 Müller 神经胶质细胞周期重新进入，并且在某些情况下，触发其随后的神经发生承诺 1,2,3,4,5。然而，这在很大程度上仍不....

研究方案

动物护理和实验是根据机构许可A91272108根据机构准则进行的。该研究方案已获得机构动物护理委员会 CEEA #59 的批准，并获得了 Direction Départementale de la Protection des Populations 的授权，参考编号为 APAFIS #32589-2021072719047904 v4 和 APAFIS #21474-2019071210549691 v2。有关这些方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。

1.机械性视网膜损伤

注意：这里描述的损伤范式方案包括从第 45 阶段开始对蝌蚪进行机械性视网膜穿刺。因此，它不针对任何特定的视网膜细胞类型，但会破坏穿刺部位视网膜的整个厚度。

  1. 制备蝌蚪麻醉剂
    1. 制备10%苯佐卡因储备溶液。总体积为 10 mL，加入 1 g 苯佐卡因、2 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 和 8 mL 丙二醇。将储备溶液在4°C下保存数月，用铝箔避光保护。
    2. 使用时，通过向50mL蝌蚪饲养水（过滤和脱氯的自来水）中加入25μL的10%苯佐卡因储备溶液来制备0.005%苯佐卡因溶液。搅拌均匀。
      注意：苯佐卡因的浓度特别低，因为与成人相比，蝌蚪对麻醉高度敏感。
  2. 引脚....

代表性结果

机械性视网膜损伤
遭受协议第 1 节中描述的机械损伤的蝌蚪视网膜切片显示，视网膜病变包含组织的所有层，同时仅限于穿刺部位（图 2A，B）。

使用 NTR-MTZ 系统的条件杆细胞消融
如方案第2节所述，在立体显微镜下分析经MTZ处理的麻醉Tg（rho：GFP-NTR）转基因蝌蚪的眼睛（图3A，B

讨论

非洲爪蟾蝌蚪各种视网膜损伤范式的优缺点

机械性视网膜损伤
在非洲爪蟾蝌蚪中已经发展出各种神经视网膜的手术损伤。神经视网膜可以完全切除 15,16 或仅部分切除16,17。这里介绍的机械损伤不涉及任何视网膜切除术，而是我们之前在非洲爪?.......

披露声明

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

这项研究得到了法国视网膜协会、法国基金会、FMR（罕见病基金会）、BBS（Bardet-Biedl 综合征协会）和 UNADEV（国家 Aveugles et Déficients Visuels）的赠款，并与 ITMO NNP（多生物体神经科学、认知科学、神经学、精神病学研究所）/AVIESAN（国家生命和健康科学联盟）合作。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Propanediol (propylène glycol)Sigma-Aldrich398039
Absolute ethanol ≥99.8%VWR chemicals20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)Cell signaling9661SDilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)AveslabsGFP-1020Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5405Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11005Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)AbcamAb183951Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11008Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11012Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5585Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)Sigma-AldrichMABN15Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5407Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)PromegaG3250
Benzocaine Sigma-AldrichE1501Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%VWR chemicals20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Apparatus)30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab diluent AgilentS202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Electronic Rotary MicrotomeThermo ScientificMicrom HM 340E 
Eosin 1% aqueousRAL Diagnostics312740
Fluorescein lysine dextran  Invitrogen Thermo ScientificD1822
Fluorescent stereomicroscopeOlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
Glycerin albumin acc. MalloryDiapathE0012Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES potassium saltSigma-AldrichH0527
Human chorionic gonadotropin hormoneMSD Animal HealthChorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC7880Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazole Sigma-Aldrich (Supelco)M3761Use at 10 mM
Microloader tipsEppendorf5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.Model P-97Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave ReagentMillipore345789
Mounting medium, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome bladeEpredia3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µmSefar06-1000/44
Paraffin histowax without DMSOHistolab00403
Paraformaldehyde solution (32%)Electron Microscopy SciencesEM-15714-SUse at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsEpredia2219
PestleVWR431-0094
Petri Dish 100 mmCorning GosselinSB93-101
Petri Dish 55 mmCorning GosselinBP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer Microinjection systemParker Instrumentation ProductsPicoSpritzer III
Pins Fine Science Tools26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )Sigma-AldrichF4375Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Powdered fry food : sera Micron Naturesera45475 (00720)
Scissors dissectionFine Science Tools14090-09
Slide Superfrost  KNITTEL GlassVS11171076FKA 
Slide warmerKunz instrumentsHP-3
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)VWR chemicals27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich (Supelco)1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)VWR chemicals28217-292
StereomicroscopeZeissStemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mLB-BRAUN9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)Integrated DNA Technologies1072533
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC Fluorescence IlluminatorX-Cite 200DC
Xylene ≥98.5% VWR chemicals28975-325

参考文献

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. ....

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