Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו מספר פרוטוקולים לגרימת נזק ברשתית או ניוון רשתית בראשנים מסוג Xenopus laevis . מודלים אלה מציעים את האפשרות לחקור מנגנוני התחדשות רשתית.

Abstract

מחלות נוירודגנרטיביות ברשתית הן הגורמים המובילים לעיוורון. בין אסטרטגיות טיפוליות רבות הנחקרות, גירוי תיקון עצמי התגלה לאחרונה כמושך במיוחד. מקור עניין תאי לתיקון רשתית הוא תא הגליה מולר, הטומן בחובו פוטנציאל תאי גזע ויכולת התחדשות יוצאת דופן באנמניוטים. עם זאת, פוטנציאל זה מוגבל מאוד ביונקים. חקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הרשתית במודלים של בעלי חיים בעלי יכולות התחדשות אמור לספק תובנות כיצד לפתוח את היכולת הסמויה של תאי מולר של יונקים לחדש את הרשתית. זהו צעד מפתח לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ברפואה רגנרטיבית. לשם כך פיתחנו מספר פרדיגמות של פגיעה ברשתית בקסנופוס: פגיעה מכנית ברשתית, קו מהונדס המאפשר אבלציה מותנית של קולטני אור בתיווך ניטרורדוקטאז, מודל רטיניטיס פיגמנטוזה המבוסס על נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, ומודל ציטוטוקסי המונע על ידי זריקות CoCl2 תוך עיניות. הדגשת היתרונות והחסרונות שלהם, אנו מתארים כאן סדרה זו של פרוטוקולים היוצרים מצבים ניווניים שונים ומאפשרים את המחקר של התחדשות הרשתית ב Xenopus.

Introduction

מיליוני אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלות ניווניות שונות ברשתית המובילות לעיוורון, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). נכון להיום, מצבים אלה נותרו במידה רבה בלתי ניתנים לטיפול. הגישות הטיפוליות הנוכחיות הנמצאות בהערכה כוללות ריפוי גנטי, השתלות תאים או רקמות, טיפולים נוירופרוטקטיים, אופטוגנטיקה והתקנים תותבים. אסטרטגיה מתפתחת נוספת מבוססת על התחדשות עצמית באמצעות הפעלת תאים אנדוגניים בעלי פוטנציאל תאי גזע. תאי גליה מסוג מולר, סוג תאי הגליה העיקריים ברשתית, הם בין המקורות התאיים המעניינים בהקשר זה. לאחר פציעה, הם יכולים להתמיין, להתרבות, וליצור נוירונים 1,2,3. למרות שתהליך זה יעיל מאוד בדגי זברה או בקסנופוס, הוא אינו יעיל במידה רבה ביונקים.

עם זאת, הוכח כי טיפולים מתאימים עם חלבונים מיטוגניים או ביטוי יתר של גורמים שונים יכולים לגרום לכניסה מחודשת של מחזור תאי גליה של יונקים, ובמקרים מסוימים, לעורראת מחויבותם לנוירוגנזה 1,2,3,4,5. עם זאת, זה עדיין לא מספיק במידה רבה לטיפולים. לפיכך, הרחבת הידע שלנו על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתחדשות נחוצה כדי לזהות מולקולות המסוגלות להפוך ביעילות תכונות תאים דמויי גזע של מולר לאסטרטגיות טיפוליות תאיות חדשות.

במטרה זו, פיתחנו מספר פרדיגמות פציעה ב - Xenopus המעוררות ניוון תאי רשתית. כאן, אנו מציגים (1) פגיעה רשתית מכנית שאינה ספציפית לסוג התא, (2) מודל אבלציה מותנה והפיך של תאים באמצעות מערכת NTR-MTZ המכוונת לתאי מוט, (3) נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה המעורר ניוון מתקדם של תאי מוט, ו-(4) CoCl2-מודל ציטוטוקסי המושרה שעל פי המינון יכול להתמקד ספציפית בקונוסים או להוביל לניוון רחב יותר של תאי הרשתית. אנו מדגישים את הייחודיות, היתרונות והחסרונות של כל פרדיגמה.

Protocol

הטיפול והניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיים, תחת רישיון מוסדי A91272108. פרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים CEEA #59 וקיבלו אישור על ידי Direction Départementale de la Protection des Populations תחת מספר הסימוכין APAFIS #32589-2021072719047904 v4 ו- APAFIS #21474-2019071210549691 v2. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים אלה.

1. פגיעה ברשתית מכנית

הערה: פרוטוקול פרדיגמת הפציעה המתואר כאן מורכב מניקוב רשתית מכני של ראשנים משלב 45 ואילך. לכן, הוא אינו מכוון לסוג מסוים של תאי רשתית אלא פוגע בכל עובי הרשתית באתר הניקוב.

  1. הכנת חומר הרדמה לראשנים
    1. הכינו תמיסת מלאי של 10% בנזוקאין. לקבלת נפח כולל של 10 מ"ל, להוסיף 1 גרם של בנזוקאין, 2 מ"ל של dimethyl sulfoxide (DMSO), ו 8 מ"ל של פרופילן גליקול. שמור על תמיסת המלאי למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    2. הכינו תמיסת 0.005% בנזוקאין בזמן השימוש על ידי הוספת 25 μL של 10% תמיסת מלאי בנזוקאין ל-50 מ"ל מים לגידול ראשנים (מי ברז מסוננים ונטולי כלור). מערבבים היטב.
      הערה: ריכוז הבנזוקאין נמוך במיוחד מכיוון שהראשנים רגישים מאוד להרדמה בהשוואה למבוגרים.
  2. הכנת סיכות
    1. חברו פין סטרילי בקוטר 0.2 מ"מ למחזיק סיכות מעוקר (איור 1A).
  3. הרדמת ראשנים
    1. השתמש ברשת טבילה כדי לתפוס ראשנים במיכלים שלהם. העבר אותם למיכל חדש המכיל את תמיסת הבנזוקאין 0.005%. המתינו מספר דקות עד שהראשנים יפסיקו להגיב לגירויים (הקשה על המיכל או מגע ישיר).
      הערה: ניתן להרדים מספר ראשנים בו זמנית, אך הזמן המושקע בתמיסת ההרדמה צריך להיות פחות מ -30 דקות.
  4. ניקוב רשתית
    1. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות על צלחת פטרי קטנה (בקוטר 55 מ"מ) המכילה רקמה רטובה. מקמו את הצד הגבי של הראשנים כלפי מעלה באמצע צלחת הפטרי.
    2. תחת סטריאומיקרוסקופ, נקבו את הרשתית על-ידי החדרה עדינה של הסיכה בצד הגבי של העין, עד שהיא תעבור דרך הרשתית (איור 1A). אם יש צורך במספר חיטוטים, חזור על הליך זה במקומות שונים. לאחר ניקוב עין ימין, סובבו את צלחת הפטרי ב-180 מעלות כדי לנקב את עין שמאל.
    3. מעבירים את הראשנים הפגועים למיכל גדול המכיל 1 ליטר מים לגידול על ידי טבילה זהירה של צלחת הפטרי. עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.

2. אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ

הפרוטוקול נועד לגרום לאבלציה ספציפית של תאי מוט בקו6 המהונדס Xenopus Tg (rho:GFP-NTR), הזמין בשירות הזואוטכני של TEFOR Paris-Saclay, המארח את מרכז המשאבים הצרפתי Xenopus. המערכת הכימוגנטית הזו משתמשת ביכולת של אנזים ניטרורדוקטאז (NTR) כדי להמיר את התרופה מטרונידזול (MTZ) לחומר צילב-קישור ציטוטוקסי של דנ"א, כדי לעבד באופן ספציפי מוטות המבטאים NTR (איור 1B). שני פרוטוקולים מפורטים ליצירת בעלי חיים טרנסגניים Tg (rho:GFP-NTR) או Tg (rho:NTR) ולגרום לניוון פורסמו בעבר 7,8. כאן, אנו פשוט מפרטים את השראת ניוון הרשתית וכיצד לפקח על תהליך הניוון in vivo.

  1. הכנת פתרון metronidazole
    1. הכינו תמיסת MTZ של 10 mM בזמן השימוש על ידי המסת 1.67 גרם אבקת MTZ בבקבוק כהה ב-1 ליטר מים לגידול ראשנים המכילים 0.1% DMSO, באמצעות מוט ערבוב מגנטי ותסיסה מגנטית.
      הערה: MTZ רגיש לאור. פירוק מלא עשוי להימשך עד 10 דקות.
  2. יצירת ראשנים טרנסגניים על ידי הזדווגות טבעית מקו Tg (rho:GFP-NTR)
    הערה: מכיוון שזכרים טרנסגניים מייצגים מלאי יקר, אנו מעדיפים ליצור עוברים באמצעות הזדווגות טבעית כדי לא להקריב את הזכר ולהשתמש בו שוב ושוב.
    1. מתן הורמונים
      1. הזריקו 600 יב"ל של הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עם מחטים של 25 גרם לתוך שק הלימפה הגבי של נקבות מסוג Xenopus laevis Wild. להזריק זכרים טרנסגניים עם 100-200 IU של hCG לתוך שק הלימפה הגבי. לניטור חי של ניוון מוטות (שלב 2.4), השתמש בקסנופוס לבקנים ולא בפיגמנטים, כדי לדמיין טוב יותר שינויים פלואורסצנטיים על פני העין של הראשנים הטרנסגניים שנוצרו.
        הערה: נקבות קסנופוס יכולות להיות מוקדנות עם 50 IU של hCG 1 עד 7 ימים לפני הביוץ המתוכנן, אבל זה אופציונלי.
    2. הזדווגות ואיסוף ביצים
      1. מיד לאחר הזרקת hCG, לשים במיכל אחד Tg (rho:GFP-NTR) זכר טרנסגני אחד יחד עם נקבה אחת hCG מוזרק ב 20 ° C עד למחרת. השתמשו בנפח גדול (לפחות 10 ליטר) והוסיפו חפצים קטנים כדי שהביצים יידבקו אליהם, כך שהביצים לא ייפגעו מתנועות הבוגרים. למחרת, כאשר הצפרדעים כבר לא באמפלקסוס, הוציאו את הבוגרים מהמכל ואספו עוברים.
    3. גידול עוברים וראשנים
      1. שלב עוברים וראשנים על פי הטבלה הרגילה של התפתחות קסנופוס 9.
      2. לגדל עוברים במיכל מלא במים לגידול ראשנים. משלב 45, להאכיל ראשנים עם אבקת מזון מטגנים ולחמצן את המים עם bubbler. יש להוסיף מים מדי יום במידת הצורך כדי לפצות על האידוי ולהחליף את כל מי המיכל מדי שבוע.
        הערה: לחלופין, ניתן גם להחליף 50% מהנפח פעמיים בשבוע. פרוטוקול מפורט ניתן למצואב-10.
    4. מיון עוברים טרנסגניים
      1. משלב 37/38, מיין ובחר עוברים טרנסגניים תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הדמיה ישירה של GFP (איור 1C).
  3. טיפול MTZ ראשנים
    1. העבר ראשנים טרנסגניים Tg (rho:GFP-NTR) למיכל המכיל תמיסת MTZ של 10 mM ומאחוריהם ב 20 ° C בחושך למשך שבוע אחד. השתמשו באחים טרנסגניים שגדלו במים לגידול ראשנים המכילים 0.1% DMSO כאמצעי ביקורת.
    2. החליפו את תמיסת ה-MTZ והבקרה אחת ליומיים במהלך תקופת הטיפול. האכילו את הראשנים כרגיל במהלך טיפול MTZ.
    3. לניטור פלואורסצנטי פרטני (שלב 2.4), הניחו כל ראשנים במיכל הקטן שלו עם 30 מ"ל MTZ או פתרון בקרה משלב 2.3.1 ואילך.
      הערה: טיפול MTZ יכול להתבצע בכל עת משלב 45 ואילך.
  4. ניטור חי של ניוון מוטות
    הערה: ניתן לעקוב אחר הניוון ההדרגתי של המוטות בזמן אמת. לכן, בצע את שלבים 2.4.1. ל-2.4.4. לפני טיפול MTZ ולאחר מכן באופן קבוע לאחר הטיפול.
    1. בצע את השלבים 1.1 ו -1.3 להכנת חומר ההרדמה וההרדמה ראשנים, בהתאמה.
    2. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות על רקמה רטובה בצלחת פטרי קטנה (קוטר 55 מ"מ). התבונן בפלואורסצנטיות GFP תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי (אורך גל עירור = 488 ננומטר ואורך גל פליטה = 509 ננומטר) וצלם את העין. ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות משקפת את השפלת המוטות.
      הערה: כדי לבצע השוואות כמותיות, יש לשמור על אותן הגדרות לצורך הדמיה של כל הראשנים.
    3. העבירו את הראשנים המצולמים למיכל גדול המכיל 1 ליטר של מי גידול על ידי טבילה זהירה של צלחת הפטרי. עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.
    4. השווה את עוצמת הפלואורסצנטיות בין עיני ראשנים שטופלו ב- MTZ לבין עיני ראשנים בבקרה כדי לפקח ולהעריך את יעילות תהליך הניוון.

3. ניוון תאי מוט על ידי נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9

הערה: פרוטוקול זה הוקם כדי ליצור מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה ב- Xenopus laevis על ידי גרימת ניוון ספציפי של תאי מוט באמצעות נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9. % ההחדרה-מחיקה (indels) ב- F0 מסופק ב-11 והוא ~ 75%. נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9 כזה יכול להתבצע גם בראשנים של Xenopus tropicalis 11.

  1. הכנת פתרונות וריאגנטים
    1. הזמנת crRNA ו-tracrRNA
      1. קנה את ה- CRISPR RNA הסינתטי (crRNA) המכוון לגן רודופסין (rho) ול- crRNA הטרנסאקטיבי הסטנדרטי (tracrRNA). ה-crRNA מורכב מאזור ספציפי למטרה של rho (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) ואזור נוסף (GUUUUAGAGCUAUGCU) שעובר הכלאה ל-tracrRNA.
    2. crRNA:דופלקס tracrRNA (דופלקס rho gRNA)
      1. השהה מחדש את crRNA ואת tracrRNA ב- 100 מיקרומטר במאגר הדו-צדדי נטול הנוקלאז.
      2. הכן את דופלקס gRNA על ידי ערבוב 3 μL של 100 μM rho crRNA, 3 μL של 100 μM tracrRNA, ו 94 μL של חיץ דופלקס. הריכוזים הסופיים הם 36 ng/μL rho crRNA, ו-67 ng/μL tracrRNA.
      3. אנקו את האוליגוס על ידי חימום שלהם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ומקררים אותם לאט לטמפרטורת החדר. הפוך aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C.
    3. קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 (כלומר, חלבון דופלקס gRNA/Cas9)
      1. בזמן השימוש, להכין את התערובת של דופלקס gRNA rho ואת חלבון Cas9. עבור 20 μL, הוסף 10 μL של תמיסת דופלקס rho gRNA, 2 μL של חלבון Cas9 (מלאי ב 5 מ"ג / מ"ל), 2 μL של פלואורסצאין ליזין דקסטרן (מלאי ב 10 מ"ג / מ"ל), ו 6 μL של מים ללא RNase.
      2. כדי ליצור את קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין, יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C ולתת לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר.
      3. לקבלת 20 μL של תמיסת הבקרה, לערבב 2 μL של חלבון Cas9, 2 μL של פלואורסצאין ליזין דקסטרן, ו 16 μL של מים ללא RNase.
    4. הכנת פתרונות MBS 10x, 1x ו- 0.1x
      1. הכינו את תמיסת מלאי המלח של Barth שונה (10x MBS) על ידי הוספת 11.92 גרם HEPES, 51.43 גרם נתרן כלורי (NaCl), 0.75 גרם אשלגן כלורי (KCl), 2.1 גרם סודיום ביקרבונט (NaHCO3), ו-2.46 גרם מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO4, 7 H2O) ב-800 מ"ל מים מסוג II. כוונן את ה- pH ל- 7.8 עם 30% נתרן הידרוקסידי (NaOH). מוסיפים מים מסוג II עד שהנפח הוא 1 L ומעקרים על ידי autoclaving. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      2. הכינו 1 ליטר של תמיסת 1x MBS על ידי דילול 100 מ"ל של תמיסת מלח 10x MBS ו-7 מ"ל של 0.1 מ"ל סידן כלורי דיהידרט (CaCl 2, 2H2O) במים מסוג II. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      3. הכן פתרון 0.1x MBS על ידי דילול תמיסת 1x MBS במים מסוג II. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
    5. פתרון בנזוקאין למבוגרים
      1. הכינו תמיסת 0.05% בנזוקאין על ידי הוספת 5 מ"ל של 10% תמיסת מלאי בנזוקאין (ראה שלב 1.1.1.) לליטר אחד של מים לגידול ראשנים. מערבבים היטב.
        הערה: שמור תמיסה זו למשך מספר חודשים בטמפרטורה של 4°C המוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. הביאו את התמיסה לטמפרטורת החדר לפני השימוש על בעלי חיים.
    6. תמיסת L-ציסטאין
      1. הכן את תמיסת dejellying בזמן השימוש על ידי הוספת 2 גרם של מונוהידראט הידרוכלורי L-ציסטאין ל 100 מ"ל של תמיסת 0.1x MBS. כוונן את רמת החומציות ל-7.8 עם 30% NaOH.
    7. תמיסת פוליסוכרוז
      1. הכינו את תמיסת הרב-סוכרוז הצפופה על ידי הוספת 3 גרם רב-סוכרוז ל-100 מ"ל של תמיסת 0.1x MBS. אחסן פתרון זה למשך מספר שבועות בטמפרטורה של 4°C.
  2. הפריה חוץ גופית ו dejellying
    הערה: פרטים נוספים על הפריה חוץ גופית של Xenopus ניתן למצוא בפרוטוקול ייעודי מפורטב-12.
    1. מתן הורמונים לנקבות Xenopus laevis לגרימת ביוץ
      1. כ-15 שעות לפני קצירת הביציות, יש להזריק 600 יחב"ל של hCG לשק הלימפה הגבי של הנקבה ולשמור אותו למשך הלילה בטמפרטורה של 18°C.
    2. דיסקציה של האשכים
      1. הרדימו את זכר הקסנופוס במינון קטלני של 0.05% תמיסת בנזוקאין למשך 10-15 דקות. כשיטת המתת חסד משלימה, יש לחתוך את עמוד השדרה מיד אחורית לגולגולת בעזרת מספריים חדים וחזקים. פתחו את חלל הבטן בעזרת מספריים לדיסקציה, גזרו את האשכים החוצה וקצצו את כל השומן והנימים המחוברים. מניחים כל אשך מיד על קרח ב 1 מ"ל של 1x MBS.
    3. הכנת זרע
      1. מרסקים אשך אחד באמצעות מזיק לצינורות מיקרוצנטריפוגות ומדללים את המתלה בצינור 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של 1x MBS. הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין לצינור האשכים השני ושמור אותו על 4 ° C למשך כמה ימים לניסויי הפריה נוספים.
    4. הפריה חוץ גופית
      1. עסו בעדינות את גב הנקבה המוזרקת בהורמונים ואספו את הביציות בצלחת פטרי (קוטר 100 מ"מ). מורחים כמה טיפות מתמיסת הזרע על הביציות. המתן 5 דקות וכסה אותם עם 0.1x MBS. המתן 10 דקות לפני שתמשיך עם dejellying.
    5. דג'לינג ביציות מופרות
      1. החלף את תמיסת 0.1x MBS בתמיסת dejellying כדי להסיר את ציפוי הג'לי מהביצים המופרות (~ 5 דקות). שטפו היטב את העוברים 5-6 פעמים עם 0.1x MBS והעבירו אותם לצלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ מלאה ב-0.1x MBS.
  3. הכנת מערכת המיקרו-הזרקה
    1. להשחיז נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה13.
    2. מלאו נימים מושחזים ב-2-10 מיקרוליטר של קומפלקס ריבונוקלפרוטאין CRISPR-Cas9 או בתמיסת הבקרה באמצעות קצה מיקרו-מטעין והכניסו את הנימים למטפל במיקרו-מזרק.
    3. בהגדלה הגבוהה ביותר של סטריאומיקרוסקופ, נתקו את קצה הנימים בעזרת מלקחיים עדינים, וכווננו את זמן ההזרקה (~400 מילישניות) לקבלת נפח פליטה של 10 nL לכל פולס. הגדר את לחץ הפליטה לסביבות 40 PSI.
  4. מיקרו-הזרקה של עובר בשלב חד-תאי עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9
    1. הניחו עוברים חד-תאיים על רשת (רקמת ניילון בקוטר 1 מ"מ) מודבקים בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ מלאה בתמיסת רב-סוכרוז 3% (איור 1D).
    2. באמצעות המיקרו-מזרק ותחת סטריאומיקרוסקופ, הזריקו 10 nL של קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9 (המתאים ל-500 pg של דופלקס gRNA + 5 ng של חלבון Cas9 לעובר) או תמיסת בקרה ברמת קוטב החי, באזור קליפת המוח, ממש מתחת לקרום הציטופלזמי.
      הערה: פלואורסצאין ליזין דקסטרן הכלול בתמיסה מאפשר מיון לאחר מכן של העוברים המוזרקים.
    3. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי חדשה בקוטר 100 מ"מ המכילה תמיסת פוליסוקרוז נקייה ומניחים אותם בטמפרטורה של 21°C.
    4. ביום הראשון, מיין באופן קבוע את העוברים המפותחים היטב והחלף את תמיסת הרב-סוכרוז ב- 0.1x MBS כ- 5 שעות לאחר מיקרו-הזרקה.
    5. המתינו 24 שעות לאחר ההזרקה כדי למיין ולבחור עוברים פריכים של rho שהוזרקו היטב תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי על-ידי הדמיה של פלואורסצאין ליזין דקסטרן (איור 1E).
      הערה: ככל שהמיקרו-הזרקה לאחר ההפריה מוקדמת יותר, כך הנוקאאוט יעיל יותר.
  5. גידול עוברים וראשנים
    1. יש לגדל עוברים פריכים של רו ב-0.1x MBS בצלחות פטרי עד לשלב 37/38. הסר עוברים מתים מדי יום ושנה את תמיסת 0.1x MBS. משלב 37/38 יש לגדל עוברים במיכל מלא במים לגידול ראשנים, ומשלב 45 להמשיך כמו בשלב 2.2.3.

4. ניוון תאי רשתית על ידי זריקות CoCl 2 תוך עיניות ציטוטוקסיות

הערה: פרוטוקול זה נקבע כדי לגרום לניוון תאי רשתית על ידי הזרקות תוך עיניות של קובלט כלוריד (CoCl2) בראשנים של Xenopus laevis . על פי המינון, זה יכול לעורר ניוון ספציפי חרוט או ניוון רחב יותר14. אנו משתמשים בפרוטוקול זה בראשנים מסוג Xenopus laevis מגיל 48 ואילך. ניתן להשתמש בו גם בראשנים מסוג Xenopus tropicalis .

  1. הכנת חיץ וריאגנטים
    1. הכינו תמיסת בנזוקאין 0.005% בזמן השימוש כמו בשלב 1.1.
    2. הכן תמיסת מלאי CoCl2 של 100 מ"מ על ידי הוספת 118.5 מ"ג עד 5 מ"ל של 0.1x MBS (ראה שלב 3.1.4 להכנת 0.1x MBS). שמור על תמיסת מלאי זו למשך מספר חודשים ב- 4 ° C, מוגן מפני אור עם רדיד אלומיניום.
      אזהרה: CoCl2 מסווג כתרכובת רעילה לחיי אדם ובעלי חיים. בצע בקפידה את ההוראות לטיפול, אחסון וסילוק פסולת בגיליון נתוני הבטיחות.
    3. עבור ניוון ספציפי לחרוט, הכן פתרון CoCl2 של 10 mM בזמן השימוש מתמיסת מלאי של 100 mM המדוללת ב- 0.1x MBS. לניוון רחב יותר של תאי הרשתית, הכינו תמיסת CoCl2 של 25 mM.
  2. הכנת מערכת ההזרקה
    1. להשחיז נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה 13.
    2. מלא נימים מושחזים עם 2-10 μL של 10 או 25 mM תמיסת CoCl2 או פתרון הבקרה (0.1x MBS) באמצעות קצה microloader והנח את הנימים לתוך המטפל microinjector.
    3. בהגדלה הגבוהה ביותר של סטריאומיקרוסקופ, נתקו את קצה הנימים בעזרת מלקחיים עדינים, וכווננו את זמן ההזרקה (כ-100 מילישניות) לקבלת נפח פליטה של 15-40 nL לכל פולס. הגדר את לחץ הפליטה ל~40 PSI.
      הערה: יש להתאים את גודל הטיפה לשלב הראשנים ולגודל העין שלהם. לדוגמה, בשלבים 48-49, גודל הטיפה הוא ~ 15-20 nL, בעוד שהוא 30-40 nL בשלבים 52-56. מבחינה ויזואלית, גודל הטיפה מעט גדול יותר מגודל העדשה.
  3. CoCl2 הזרקות תוך עיניות
    1. השתמש ברשת טבילה כדי לתפוס ראשנים במיכלים שלהם. העבר אותם ל 50 מ"ל של תמיסת בנזוקאין 0.005%. המתינו מספר דקות עד שהראשנים יפסיקו להגיב לגירויים.
      הערה: ניתן להרדים מספר ראשנים בו זמנית, אך זמן ההרדמה צריך להיות פחות מ-30 דקות.
    2. השתמשו בכפית כדי לתפוס ראשן אחד והניחו אותו בזהירות בכלי פטרי קטן (קוטר 55 מ"מ) המכיל רקמה רטובה. מקמו את הצד הגבי של הראשנים כלפי מעלה במרכז צלחת הפטרי (איור 1F,G).
    3. השתמש במיקרו-מזרק תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להזריק תוך עינית את תמיסת CoCl2 . הכנס בעדינות את הנימים לעין מעל העדשה. כאשר קצה הנימים נמצא בתוך העין, יש להוציא שתי טיפות לכל עין. לאחר הזרקת עין ימין, סובבו את צלחת הפטרי ידנית ב-180 מעלות כדי להזריק לעין שמאל.
      הערה: יש לוודא כי ההזרקה נעשית בתוך העין, כך שיש לראות נפיחות קלה של העין לאחר כל פליטה של התמיסה. הראשנים צריכים להישאר מחוץ למים כמה שפחות. ההזרקה של שתי העיניים צריכה לקחת פחות מ 1 דקה.
    4. העבירו את הראשנים המוזרקים למכל גדול שמכיל 1 ליטר של מים לגידול על-ידי טבילתם בזהירות בצלחת הפטרי (איור 1H). עקוב אחר הראשנים עד שהם מתעוררים לחלוטין.

5. צביעה להערכת נזק ברשתית או ניוון רשתית

  1. קיבוע ראשנים והתייבשות
    1. הכן תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) על ידי דילול 100 מ"ל של תמיסת PFA 32% ל-700 מ"ל של PBS אחד. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם NaOH. Aliquot פתרון מלאי זה ולשמר אותו במשך מספר חודשים ב -20 ° C.
    2. הרדימו את הראשנים ב-0.01% בנזוקאין והעבירו אותם לבקבוקון המכיל 4% PFA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה או לילה ב-4°C. יש לשטוף 3 x 5 דקות ב-PBS אחד.
    3. מייבשים בהדרגה ראשנים על ידי דגירות רצופות של 30 דקות באתנול 70% ו-95% אתנול (מדולל במים מסוג II), ולאחר מכן שלוש דגירות נוספות של שעה אחת באתנול 100%. אחסנו את ראשי הראשנים בשלב זה בטמפרטורה של -20°C או העבירו אותם ישירות ל-100% בוטנול למשך הלילה לצעדים נוספים.
  2. חתך פרפין
    1. החליפו 100% בוטנול בפרפין מומס למשך שעתיים ב-62°C. החלף את הפרפין במשך 2 x 2 שעות של דגירות נוספות ב 62 ° C.
    2. מעבירים את ראשי הראשנים בתבניות הטבעה חד פעמיות של פרפין ומכוונים אותם כך שעיניהם מיושרות היטב, ואז מאפשרים לפרפין להתקשות. אחסנו את הבלוקים בטמפרטורת החדר.
    3. חתכו את עודפי הפרפין והרכיבו את הבלוק עם הראשנים המוטבעים על תמיכת המיקרוטום.
    4. חותכים את הבלוק עם מיקרוטום בעובי המתאים (10-12 מיקרומטר). העבירו את הסרטים עם מקטעים בשקופית שכוסה בעבר באלבומין גליצרין 3% (מדולל במים).
    5. הניחו את המגלשה על מגלשה חמה יותר בטמפרטורה של 42°C למשך מספר דקות ולאחר מכן הסירו את עודפי אלבומין הגליצרין. תנו למגלשות להתייבש לילה בתנור ב-37°C.
    6. ניתן לטבול את המגלשות במשך 2X15 דקות בצנצנת קופלין מלאה ב-100% קסילן. התייבשו מחדש את החלקים עם סדרת אתנול מדורגת: 100% פעמיים, 70%, 50% (מדולל במים מסוג II), ~ 5 דקות כל אחד, ואחריו 2 x 5 דקות במים.
  3. תיוג Immunofluorescence
    1. הכן תמיסת מלאי נתרן ציטראט (CiNa) של 100 מ"מ על ידי הוספת 29.4 גרם של נתרן ציטראט מלח טריסודיום דיהידרט (C6H5Na3O7, 2H2O) ל 1 ליטר של מים מסוג II; כוונן את ה- pH ל- 6 עם חומצה הידרוכלורית (HCl). יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג ולאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים. הכן את פתרון הסרת המסיכה בזמן השימוש על ידי הוספת 25 מ"ל של 100 מ"ל תמיסת מלאי CiNa ל 225 מ"ל של מים מסוג II. מוסיפים 125 μL של Tween-20 ומערבבים היטב (הריכוז הסופי הוא 10 mM CiNa, 0.05% Tween-20).
    2. הכן תמיסת מלאי Hoechst ב 10 מ"ג / מ"ל על ידי הוספת 100 מ"ג של bisBenzimide H 33258 ל 10 מ"ל של מים מסוג I. שמור על תמיסת מלאי זו למשך מספר חודשים ב- 4 ° C, מוגן מפני אור עם רדיד אלומיניום. הכן את תמיסת Hoechst ב-7.5 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Hoechst ל-400 מ"ל של 1x PBS.
      הערה: ניתן להשתמש בתמיסה זו עד 10 פעמים ולשמר אותה למשך כ-6 חודשים בטמפרטורה של 4°C, כשהיא מוגנת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    3. לאחר הסרת החלקים יש לבצע שליפת אנטיגן על ידי הרתחת החלקים בתמיסת הסרת המסכה למשך 9 דקות. תנו לתמיסה להתקרר במשך 20 דקות.
    4. יש לשטוף פעם אחת במים מסוג II ופעם אחת ב-1x PBS. הניחו את המגלשות שטוחות בתא לח והוסיפו 400-600 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל שקופית (דילול נוגדנים + 0.2% טריטון X100) למשך 30 דקות.
    5. החלף את פתרון החסימה ב- 200 μL לכל שקופית של הנוגדן העיקרי המדולל בתמיסת החסימה. השתמש ב- coverslip כדי לפזר את התמיסה על פני המקטעים, הימנעות היווצרות בועות. יש לדגור למשך הלילה ב-4 °C (75 °F) בתא לח.
    6. מעבירים את המגלשות לצנצנת Coplin ושוטפים במשך 3 x 10 דקות ב-1x PBS בתוספת 0.1% Triton X100. הניחו את המגלשות שטוחות, הוסיפו 400 מיקרוליטר לכל שקופית של הנוגדן המשני המדולל בתמיסת חסימה, והשאירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתא לח.
    7. העבירו את המגלשות לצנצנת Coplin ושטפו במשך 3 x 5 דקות עם PBS אחד בתוספת 0.1% Triton X100.
    8. גרעיני תאים נגד כתמים עם תמיסת Hoechst למשך 10 דקות ושטפו 3 x 5 דקות עם 1x PBS.
    9. הניחו את הכיסויים מעל מגלשות באמצעי הרכבה מימי שתוכנן במיוחד לשימור פלואורסצנטיות. הניחו למגלשות להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C.
    10. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  4. צביעת Hematoxylin ו-eosin (H&E) להערכת נזק לרשתית
    הערה: במקום לתייג סוג תא מסוים על ידי immunostaining, היסטולוגיה רשתית כללית ניתן להעריך עם צבע H&E.
    1. לאחר הסרת השעווה, יש לבצע תיוג חומצות גרעין על ידי טבילת שקופיות בתמיסת המטוקסילין למשך 2 דקות. יש לשטוף היטב במי ברז.
    2. בצע תיוג ציטופלסמה על ידי טבילת שקופיות בתמיסת eosin 1% למשך דקה אחת. יש לשטוף במהירות במים.
      הערה: אאוסין מסיס מאוד; אם המגלשות נשארות זמן רב מדי במים, כל הצבע נעלם.
    3. יש לשטוף 2 x 5 דקות באתנול 100% ו-2 x 5 דקות בקסילן.
    4. מתחת למכסה המנוע, הניחו את הכיסויים מעל המגלשות ב-4-5 טיפות של מדיום הרכבה. תנו לשקופיות להתייבש מתחת למכסה המנוע ודמיינו למחרת עם מיקרוסקופ.
  5. איתור תאים אפופטוטיים
    1. לאחר הסרת שעווה (ראה סעיף 5.2.6), פעל לפי פרוטוקול יצרן הערכה כדי לזהות פיצול DNA אפופטוטי.
    2. בצע צביעת גרעינים על ידי טבילת שקופיות בתמיסת Hoechst (ראה סעיף 5.3.8) והרכבה עם אמצעי הרכבה מימי שתוכנן במיוחד לשימור פלואורסצנטיות. הניחו למגלשות להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C.
    3. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

פגיעה מכנית ברשתית
קטעי רשתית של ראשנים הנתונים לפגיעה המכנית המתוארת בפרוטוקול סעיף 1 מראים שהנגע ברשתית מקיף את כל שכבות הרקמה תוך שהוא נשאר מוגבל לאתר הניקוב (איור 2A,B).

אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ
העיניים של ר...

Discussion

יתרונות וחסרונות של פרדיגמות שונות של פגיעה ברשתית בראשנים של קסנופוס

פגיעה מכנית ברשתית
פציעות כירורגיות שונות של הרשתית העצבית פותחו בראשנים של קסנופוס. הרשתית העצבית יכולה להיות מוסרת לחלוטין15,16 או נכרתה רק חלקית <...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ל- M.P. מהאגודה Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) ו- UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) בשיתוף עם ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Propanediol (propylène glycol)Sigma-Aldrich398039
Absolute ethanol ≥99.8%VWR chemicals20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)Cell signaling9661SDilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)AveslabsGFP-1020Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5405Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11005Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)AbcamAb183951Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11008Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11012Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5585Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)Sigma-AldrichMABN15Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5407Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)PromegaG3250
Benzocaine Sigma-AldrichE1501Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%VWR chemicals20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Apparatus)30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab diluent AgilentS202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Electronic Rotary MicrotomeThermo ScientificMicrom HM 340E 
Eosin 1% aqueousRAL Diagnostics312740
Fluorescein lysine dextran  Invitrogen Thermo ScientificD1822
Fluorescent stereomicroscopeOlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
Glycerin albumin acc. MalloryDiapathE0012Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES potassium saltSigma-AldrichH0527
Human chorionic gonadotropin hormoneMSD Animal HealthChorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC7880Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazole Sigma-Aldrich (Supelco)M3761Use at 10 mM
Microloader tipsEppendorf5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.Model P-97Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave ReagentMillipore345789
Mounting medium, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome bladeEpredia3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µmSefar06-1000/44
Paraffin histowax without DMSOHistolab00403
Paraformaldehyde solution (32%)Electron Microscopy SciencesEM-15714-SUse at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsEpredia2219
PestleVWR431-0094
Petri Dish 100 mmCorning GosselinSB93-101
Petri Dish 55 mmCorning GosselinBP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer Microinjection systemParker Instrumentation ProductsPicoSpritzer III
Pins Fine Science Tools26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )Sigma-AldrichF4375Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Powdered fry food : sera Micron Naturesera45475 (00720)
Scissors dissectionFine Science Tools14090-09
Slide Superfrost  KNITTEL GlassVS11171076FKA 
Slide warmerKunz instrumentsHP-3
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)VWR chemicals27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich (Supelco)1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)VWR chemicals28217-292
StereomicroscopeZeissStemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mLB-BRAUN9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)Integrated DNA Technologies1072533
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC Fluorescence IlluminatorX-Cite 200DC
Xylene ≥98.5% VWR chemicals28975-325

References

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

M 252M 252CRISPR Cas9CoCl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved