A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו מספר פרוטוקולים לגרימת נזק ברשתית או ניוון רשתית בראשנים מסוג Xenopus laevis . מודלים אלה מציעים את האפשרות לחקור מנגנוני התחדשות רשתית.

Abstract

מחלות נוירודגנרטיביות ברשתית הן הגורמים המובילים לעיוורון. בין אסטרטגיות טיפוליות רבות הנחקרות, גירוי תיקון עצמי התגלה לאחרונה כמושך במיוחד. מקור עניין תאי לתיקון רשתית הוא תא הגליה מולר, הטומן בחובו פוטנציאל תאי גזע ויכולת התחדשות יוצאת דופן באנמניוטים. עם זאת, פוטנציאל זה מוגבל מאוד ביונקים. חקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הרשתית במודלים של בעלי חיים בעלי יכולות התחדשות אמור לספק תובנות כיצד לפתוח את היכולת הסמויה של תאי מולר של יונקים לחדש את הרשתית. זהו צעד מפתח לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ברפואה רגנרטיבית. לשם כך פיתחנו מספר פרדיגמות של פגיעה ברשתית בקסנופוס: פגיעה מכנית ברשתית, קו מהונדס המאפשר אבלציה מותנית של קולטני אור בתיווך ניטרורדוקטאז, מודל רטיניטיס פיגמנטוזה המבוסס על נוקאאוט רודופסין בתיווך CRISPR/Cas9, ומודל ציטוטוקסי המונע על ידי זריקות CoCl2 תוך עיניות. הדגשת היתרונות והחסרונות שלהם, אנו מתארים כאן סדרה זו של פרוטוקולים היוצרים מצבים ניווניים שונים ומאפשרים את המחקר של התחדשות הרשתית ב Xenopus.

Introduction

מיליוני אנשים ברחבי העולם סובלים ממחלות ניווניות שונות ברשתית המובילות לעיוורון, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). נכון להיום, מצבים אלה נותרו במידה רבה בלתי ניתנים לטיפול. הגישות הטיפוליות הנוכחיות הנמצאות בהערכה כוללות ריפוי גנטי, השתלות תאים או רקמות, טיפולים נוירופרוטקטיים, אופטוגנטיקה והתקנים תותבים. אסטרטגיה מתפתחת נוספת מבוססת על התחדשות עצמית באמצעות הפעלת תאים אנדוגניים בעלי פוטנציאל תאי גזע. תאי גליה מסוג מולר, סוג תאי הגליה העיקריים ברשתית, הם בין המקורות התאיים המעניינים בהקשר זה. לאחר פציעה, הם יכולים להתמיין, להתרבות, וליצור נוירונים 1,2,3

Protocol

הטיפול והניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיים, תחת רישיון מוסדי A91272108. פרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים CEEA #59 וקיבלו אישור על ידי Direction Départementale de la Protection des Populations תחת מספר הסימוכין APAFIS #32589-2021072719047904 v4 ו- APAFIS #21474-2019071210549691 v2. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים אלה.

1. פגיעה ברשתית מכנית

הערה: פרוטוקול פרדיגמת הפציעה המתואר כאן מורכב מניקוב רשתית מכני של ראשנים משלב 45 ואילך. לכן, הוא אינו מכוון לסוג מסוים של תאי רשתית אלא פוגע ב....

תוצאות

פגיעה מכנית ברשתית
קטעי רשתית של ראשנים הנתונים לפגיעה המכנית המתוארת בפרוטוקול סעיף 1 מראים שהנגע ברשתית מקיף את כל שכבות הרקמה תוך שהוא נשאר מוגבל לאתר הניקוב (איור 2A,B).

אבלציה מותנית של תאי מוט באמצעות מערכת NTR-MTZ
העיניים של ר.......

Discussion

יתרונות וחסרונות של פרדיגמות שונות של פגיעה ברשתית בראשנים של קסנופוס

פגיעה מכנית ברשתית
פציעות כירורגיות שונות של הרשתית העצבית פותחו בראשנים של קסנופוס. הרשתית העצבית יכולה להיות מוסרת לחלוטין15,16 או נכרתה רק חלקית <.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ל- M.P. מהאגודה Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) ו- UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) בשיתוף עם ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Propanediol (propylène glycol)Sigma-Aldrich398039
Absolute ethanol ≥99.8%VWR chemicals20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)Cell signaling9661SDilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)AveslabsGFP-1020Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5405Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11005Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)AbcamAb183951Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11008Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)Invitrogen Thermo ScientificA11012Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5585Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)Sigma-AldrichMABN15Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)Sigma-AldrichAB5407Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)PromegaG3250
Benzocaine Sigma-AldrichE1501Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%VWR chemicals20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Apparatus)30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab diluent AgilentS202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Electronic Rotary MicrotomeThermo ScientificMicrom HM 340E 
Eosin 1% aqueousRAL Diagnostics312740
Fluorescein lysine dextran  Invitrogen Thermo ScientificD1822
Fluorescent stereomicroscopeOlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
Glycerin albumin acc. MalloryDiapathE0012Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES potassium saltSigma-AldrichH0527
Human chorionic gonadotropin hormoneMSD Animal HealthChorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC7880Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazole Sigma-Aldrich (Supelco)M3761Use at 10 mM
Microloader tipsEppendorf5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.Model P-97Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave ReagentMillipore345789
Mounting medium, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome bladeEpredia3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µmSefar06-1000/44
Paraffin histowax without DMSOHistolab00403
Paraformaldehyde solution (32%)Electron Microscopy SciencesEM-15714-SUse at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding MoldsEpredia2219
PestleVWR431-0094
Petri Dish 100 mmCorning GosselinSB93-101
Petri Dish 55 mmCorning GosselinBP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer Microinjection systemParker Instrumentation ProductsPicoSpritzer III
Pins Fine Science Tools26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )Sigma-AldrichF4375Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Powdered fry food : sera Micron Naturesera45475 (00720)
Scissors dissectionFine Science Tools14090-09
Slide Superfrost  KNITTEL GlassVS11171076FKA 
Slide warmerKunz instrumentsHP-3
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)VWR chemicals27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich (Supelco)1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)VWR chemicals28217-292
StereomicroscopeZeissStemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mLB-BRAUN9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)Integrated DNA Technologies1072533
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC Fluorescence IlluminatorX-Cite 200DC
Xylene ≥98.5% VWR chemicals28975-325

References

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

M 252M 252CRISPR Cas9CoCl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved