Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

Resumo

Desenvolvemos vários protocolos para induzir dano ou degeneração retiniana em girinos de Xenopus laevis . Esses modelos oferecem a possibilidade de estudar mecanismos de regeneração retiniana.

Resumo

As doenças neurodegenerativas da retina são as principais causas de cegueira. Dentre as inúmeras estratégias terapêuticas exploradas, o estímulo à auto-reparação emergiu recentemente como particularmente atraente. Uma fonte celular de interesse para o reparo da retina é a célula glial de Müller, que abriga potencial de células-tronco e extraordinária capacidade regenerativa em anamniotas. Este potencial é, no entanto, muito limitado em mamíferos. O estudo dos mecanismos moleculares subjacentes à regeneração retiniana em modelos animais com capacidades regenerativas deve fornecer informações sobre como desbloquear a capacidade latente das células de Müller de mamíferos de regenerar a retina. Este é um passo fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na medicina regenerativa. Para isso, desenvolvemos vários paradigmas de lesão retiniana em Xenopus: uma lesão retiniana mecânica, uma linha transgênica que permite a ablação condicional de fotorreceptores mediada por nitroredutase, um modelo de retinose pigmentar baseado em knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 e um modelo citotóxico conduzido por injeções intraoculares de CoCl₂ . Destacando suas vantagens e desvantagens, descrevemos aqui esta série de protocolos que geram várias condições degenerativas e permitem o estudo da regeneração retiniana em Xenopus.

Introdução

Milhões de pessoas em todo o mundo são acometidas por várias doenças degenerativas da retina que levam à cegueira, como retinose pigmentar, retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Até o momento, essas condições permanecem em grande parte intratáveis. As abordagens terapêuticas atuais em avaliação incluem terapia gênica, transplantes de células ou tecidos, tratamentos neuroprotetores, optogenética e dispositivos protéticos. Outra estratégia emergente baseia-se na autorregeneração por meio da ativação de células endógenas com potencial de células-tronco. As células gliais de Müller, o principal tipo de célula glial da retina, estão entre as fontes celulares de interesse nesse contexto. Ao serem lesados, podem se desdiferenciar, proliferar e gerar neurônios ^1,2,3. Embora este processo seja muito eficaz em peixes-zebra ou Xenopus, é em grande parte ineficiente em mamíferos.

No entanto, tem sido demonstrado que tratamentos adequados com proteínas mitogênicas ou superexpressão de vários fatores podem induzir a reentrada no ciclo celular da glia de Müller de mamíferos e, em alguns casos, desencadear seu subsequente comprometimento neurogênico 1,2,3,4,5. Isso permanece, no entanto, em grande parte insuficiente para os tratamentos. Assim, aumentar nosso conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes à regeneração é necessário para identificar moléculas capazes de transformar eficientemente as propriedades das células-tronco de Müller em novas estratégias terapêuticas celulares.

Com esse objetivo, desenvolvemos vários paradigmas de lesão em Xenopus que desencadeiam a degeneração das células da retina. Aqui, apresentamos (1) uma lesão mecânica retiniana que não é específica do tipo celular, (2) um modelo de ablação celular condicional e reversível usando o sistema NTR-MTZ que tem como alvo as células bastonetes, (3) um knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9, um modelo de retinose pigmentar que desencadeia degeneração progressiva de células bastonetes e ( 4) uma CoCl₂-modelo citotóxico induzido que, de acordo com a dose, pode visar especificamente os cones ou levar a uma degeneração celular mais ampla da retina. Destacamos as particularidades, vantagens e desvantagens de cada paradigma.

Protocolo

Os cuidados com os animais e a experimentação foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais, sob a licença institucional A91272108. Os protocolos do estudo foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados com animais CEEA #59 e receberam autorização da Direção Départementale de la Protection des Populations sob o número de referência APAFIS #32589-2021072719047904 v4 e APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e reagentes usados nesses protocolos.

1. Lesão mecânica da retina

NOTA: O protocolo paradigmático de lesão aqui descrito consiste em uma punção retiniana mecânica de um girino a partir do estágio 45. Portanto, não tem como alvo nenhum tipo específico de célula da retina, mas danifica toda a espessura da retina no local da punção.

1. Preparo do anestésico para girinos
   1. Prepare uma solução-estoque de benzocaína a 10%. Para um volume total de 10 mL, adicionar 1 g de benzocaína, 2 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) e 8 mL de propilenoglicol. Conservar a solução-mãe durante vários meses a 4 °C protegida da luz com papel alumínio.
   2. Preparar a solução de benzocaína a 0,005% no momento da utilização, adicionando 25 μL de solução-mãe de benzocaína a 10% a 50 ml de água de criação de girinos (água filtrada e desclorada da torneira). Misture bem.
      NOTA: A concentração de benzocaína é particularmente baixa porque os girinos são altamente sensíveis à anestesia em comparação com adultos.
2. Preparação de pinos
   1. Conecte um pino estéril de 0,2 mm de diâmetro a um suporte de pino esterilizado (Figura 1A).
3. Anestesia com girino
   1. Use uma rede de mergulho para capturar girinos em seus tanques. Transfira-os para um novo tanque contendo a solução de benzocaína a 0,005%. Aguarde alguns minutos até que os girinos parem de reagir aos estímulos (batendo no tanque ou contato direto).
      OBS: Vários girinos podem ser anestesiados simultaneamente, mas o tempo gasto na solução anestésica deve ser inferior a 30 min.
4. Punção retiniana
   1. Use uma colher para pegar um girino e coloque-o cuidadosamente em uma pequena placa de Petri (55 mm de diâmetro) contendo um tecido úmido. Posicione o dorsal do girino no meio da placa de Petri.
   2. Ao microscópio estereoscópico, puncione a retina inserindo suavemente o pino no lado dorsal do olho, até que passe pela retina (Figura 1A). Se forem necessários vários cutucadas, repita este procedimento em locais diferentes. Após puncionar o olho direito, vire a placa de Petri 180° para puncionar o olho esquerdo.
   3. Transfira o girino lesionado para um tanque grande contendo 1 L de água de criação, imergindo cuidadosamente a placa de Petri. Monitore os girinos até que estejam totalmente despertos.

2. Ablação condicional de células bastonetes usando o sistema NTR-MTZ

O protocolo visa induzir a ablação de células bastonetes específicas na linha^transgênica 6 do Xenopus Tg(rho:GFP-NTR), disponível no serviço de zootecnia da TEFOR Paris-Saclay, que hospeda o centro de recursos francês Xenopus. Esse sistema quimiogenético utiliza a capacidade da enzima nitroredutase (NTR) de converter a pró-droga metronidazol (MTZ) em um agente de reticulação citotóxico do DNA, para especificamente abater bastonetes que expressam NTR (Figura 1B). Dois protocolos detalhados para tornar Tg(rho:GFP-NTR) ou Tg(rho:NTR) animais transgênicos e induzir degeneração foram publicados anteriormente ^7,8. Aqui, nós simplesmente detalhamos a indução da degeneração retiniana e como monitorar o processo de degeneração in vivo.

1. Preparação da solução de metronidazol
   1. Preparar a solução de MTZ a 10 mM no momento da utilização, dissolvendo 1,67 g de pó de MTZ num frasco escuro em 1 L de água de criação de girinos contendo 0,1% de DMSO, utilizando uma barra de agitação magnética e um agitador magnético.
      NOTA: MTZ é sensível à luz. A dissolução completa pode levar até 10 minutos.
2. Geração de girinos transgênicos por acasalamento natural a partir da linhagem Tg(rho:GFP-NTR)
   NOTA: Como os machos transgênicos representam um estoque precioso, preferimos gerar embriões via acasalamento natural para não sacrificar o macho e usá-lo repetidamente.
   1. Administração hormonal
      1. Injetar 600 UI de hormônio gonadotrofina coriônica humana (hCG) com agulhas 25G no saco linfático dorsal de fêmeas selvagens de Xenopus laevis . Injetar machos transgênicos com 100-200 UI de hCG no saco linfático dorsal. Para o monitoramento vivo da degeneração dos bastonetes (passo 2.4), use Xenopus albino em vez de pigmentados, para visualizar melhor as variações de fluorescência através do olho dos girinos transgênicos gerados.
         NOTA: As fêmeas de Xenopus podem ser preparadas com 50 UI de hCG 1 a 7 dias antes da ovulação planejada, mas isso é opcional.
   2. Acasalamento e coleta de ovos
      1. Imediatamente após a injeção de hCG, colocar em um tanque um macho transgênico de Tg(rho:GFP-NTR) juntamente com uma fêmea injetada de hCG a 20 °C até o dia seguinte. Use um grande volume (pelo menos 10 L) e adicione pequenos objetos para os ovos aderirem, para que os ovos não sejam danificados pelos movimentos dos adultos. No dia seguinte, quando as rãs não estiverem mais no amplexo, retire os adultos do tanque e colete embriões.
   3. Criação de embriões e girinos
      1. Estádio de embriões e girinos de acordo com a tabela normal de desenvolvimento de Xenopus ⁹.
      2. Crie embriões em um tanque cheio de água de criação de girinos. A partir do estágio 45, alimente girinos com alimentos fritos em pó e oxigene a água com um borbulhador. Adicione água diariamente, se necessário, para compensar a evaporação e troque toda a água do tanque semanalmente.
         OBS: Alternativamente, também é possível trocar 50% do volume duas vezes por semana. Um protocolo detalhado pode ser encontrado em¹⁰.
   4. Triagem de embriões transgênicos
      1. A partir do estágio 37/38, classificar e selecionar embriões transgênicos sob estereomicroscópio de fluorescência, visualizando diretamente a GFP (Figura 1C).
3. Tratamento com girino MTZ
   1. Transfira girinos transgênicos Tg(rho:GFP-NTR) para um tanque contendo solução MTZ de 10 mM e os crie a 20 °C na escuridão por 1 semana. Utilizar irmãos transgênicos criados em água de criação de girinos contendo 0,1% de DMSO como controle.
   2. Troque o MTZ e a solução de controle a cada dois dias durante o período de tratamento. Alimente os girinos como de costume durante o tratamento MTZ.
   3. Para a monitorização individual da fluorescência (passo 2.4), colocar cada girino no seu pequeno recipiente com 30 ml de MTZ ou solução de controlo a partir do passo 2.3.1.
      NOTA: O tratamento MTZ pode ser realizado a qualquer momento a partir do estágio 45.
4. Monitoramento ao vivo da degeneração de hastes
   OBS: A degeneração progressiva das hastes pode ser monitorada em tempo real. Portanto, execute as etapas 2.4.1. ao ponto 2.4.4. antes do tratamento com MTZ e depois regularmente após o tratamento.
   1. Seguir os passos 1.1 e 1.3 para a preparação do anestésico e da anestesia com girino, respectivamente.
   2. Use uma colher para pegar um girino e coloque-o cuidadosamente em um tecido úmido em uma pequena placa de Petri (55 mm de diâmetro). Observar a fluorescência da GFP sob estereomicroscópio fluorescente (comprimento de onda de excitação = 488 nm e comprimento de onda de emissão = 509 nm) e tirar fotografias do olho. A diminuição da intensidade da fluorescência reflete a degradação dos bastões.
      NOTA: Para fazer comparações quantitativas, as mesmas configurações devem ser mantidas para a obtenção de imagens de todos os girinos.
   3. Transfira o girino fotografado para um grande tanque contendo 1 L de água de criação imergindo cuidadosamente a placa de Petri. Monitore os girinos até que estejam totalmente despertos.
   4. Comparar a intensidade da fluorescência entre olhos de girino tratados com MTZ e de controle para monitorar e avaliar a eficácia do processo de degeneração.

3. Degeneração de células bastonetes por knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9

NOTA: Este protocolo é estabelecido para gerar um modelo de retinose pigmentar em Xenopus laevis induzindo degeneração específica de células bastonetes usando knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9. A % de inserção-deleção (indels) em F0 é fornecida em¹¹ e é de ~75%. Tal knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 também pode ser realizado em girinos de Xenopus tropicalis ¹¹.

1. Preparação de soluções e reagentes
   1. Solicitação de crRNA e tracrRNA
      1. Compre o RNA CRISPR sintético (crRNA) visando o gene da rodopsina (rho) e o crRNA transativador padrão (tracrRNA). O crRNA é composto por uma região rho alvo-específica (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) e outra (GUUUUAGAGCUAUGCU) que hibridiza ao tracrRNA.
   2. crRNA:duplex de tracrRNA (duplex de rho gRNA)
      1. Ressuspender o crRNA e o tracrRNA a 100 μM no tampão duplex livre de nucleases.
      2. Prepare o duplex de gRNA misturando 3 μL de 100 μM de rho crRNA, 3 μL de 100 μM de tracrRNA e 94 μL de tampão duplex. As concentrações finais são 36 ng/μL rho crRNA e 67 ng/μL tracrRNA.
      3. Recozer os oligos aquecendo-os a 95 °C durante 5 min e arrefecê-los lentamente até à temperatura ambiente. Faça alíquotas e guarde-as a -20 °C.
   3. Complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 (ou seja, proteína duplex/Cas9 de gRNA)
      1. No momento do uso, prepare a mistura de rho gRNA duplex e a proteína Cas9. Para 20 μL, adicionar 10 μL da solução duplex rho gRNA, 2 μL de proteína Cas9 (estoque a 5 mg/mL), 2 μL de fluoresceína lisina dextran (estoque a 10 mg/mL) e 6 μL de água livre de RNase.
      2. Para formar o complexo ribonucleoproteína, incubar durante 10 min a 37 °C e deixar arrefecer a solução até à temperatura ambiente.
      3. Para 20 μL da solução controle, misturar 2 μL de proteína Cas9, 2 μL de fluoresceína lisina dextrana e 16 μL de água livre de RNase.
   4. Preparação de soluções MBS de 10x, 1x e 0,1x
      1. Preparar solução salina de Barth modificada (10x MBS) adicionando 11,92 g de HEPES, 51,43 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,75 g de cloreto de potássio (KCl), 2,1 g de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) e 2,46 g de sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO₄, 7 H₂O) em 800 mL de água tipo II. Ajustar o pH para 7,8 com hidróxido de sódio (NaOH) a 30%. Adicionar água tipo II até atingir o volume de 1 L e esterilizar em autoclavagem. Conservar à temperatura ambiente.
      2. Preparar 1 L de solução de 1x MBS diluindo 100 mL de solução salina de 10x MBS e 7 mL de cloreto de cálcio 0,1 M di-hidratado (CaCl 2, 2H₂ O) em água tipoII. Conservar à temperatura ambiente.
      3. Preparar 0,1x solução de MBS diluindo 1x solução de MBS em água tipo II. Conservar à temperatura ambiente.
   5. Solução de benzocaína para adultos
      1. Preparar uma solução de benzocaína a 0,05% adicionando 5 ml de solução-mãe de benzocaína a 10% (ver passo 1.1.1.) a 1 L de água de criação de girinos. Misture bem.
         NOTA: Conservar esta solução durante vários meses a 4 °C protegida da luz com folha de alumínio. Levar a solução à temperatura ambiente antes de ser utilizada em animais.
   6. Solução de L-cisteína
      1. Preparar a solução dejellying no momento da utilização adicionando 2 g de L-cisteína clorídrica monohidratada a 100 ml de solução 0,1x MBS. Ajustar o pH para 7,8 com NaOH a 30%.
   7. Solução de polissacarose
      1. Preparar a solução densa de polissarose, adicionando 3 g de polissarose, a 100 ml de solução de 0,1x MBS. Conservar esta solução durante algumas semanas a 4 °C.
2. Fertilização in vitro e dejellying
   NOTA: Mais detalhes sobre a fertilização in vitro Xenopus podem ser encontrados em um protocolo dedicado detalhado em¹².
   1. Administração hormonal a fêmeas de Xenopus laevis para induzir a ovulação
      1. Aproximadamente 15 h antes da colheita do ovócito, injete 600 UI de hCG no saco linfático dorsal da fêmea e mantenha-o durante a noite a 18 °C.
   2. Dissecção testicular
      1. Eutanasiar o macho de Xenopus com uma dose letal de solução de benzocaína a 0,05% por 10-15 min. Como método complementar de eutanásia, cortar a coluna imediatamente posterior ao crânio com uma tesoura afiada e resistente. Abra a cavidade abdominal com tesoura de dissecção, corte os testículos e corte qualquer gordura e capilares aderidos. Colocar cada testículo imediatamente no gelo em 1 mL de 1x MBS.
   3. Preparação de espermatozoides
      1. Esmagar um testículo usando um pilão para tubos de microcentrífuga e diluir a suspensão em um tubo de 15 mL contendo 9 mL de 1x MBS. Adicionar 10 μg/mL de gentamicina ao segundo tubo testicular e mantê-lo a 4 °C por alguns dias para novos experimentos de fertilização.
   4. Fertilização in vitro
      1. Massageie suavemente o dorso da fêmea injetada com hormônio e colete os ovócitos em uma placa de Petri (100 mm de diâmetro). Espalhe algumas gotas da solução espermática para os ovócitos. Aguarde 5 min e cubra-os com 0,1x MBS. Aguarde 10 minutos antes de prosseguir com o dejellying.
   5. Dejellying de óvulos fertilizados
      1. Substitua a solução de 0,1x MBS pela solução dejellying para remover a camada de gelatina dos ovos fertilizados (~5 min). Lave completamente os embriões 5-6 vezes com 0,1x MBS e transfira-os para uma nova placa de Petri de 100 mm preenchida com 0,1x MBS.
3. Preparação do sistema de microinjeção
   1. Afiar os capilares de vidro com um extrator de micropipeta¹³.
   2. Preencha um capilar afiado com 2-10 μL do complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 ou a solução de controle usando uma ponta de microcarregador e coloque o capilar no manipulador do microinjetor.
   3. Na maior magnificação de um estereomicroscópio, rompa a ponta capilar com pinça fina e ajuste o tempo de injeção (~400 ms) para obter um volume de ejeção de 10 nL por pulso. Ajuste a pressão de ejeção para cerca de 40 PSI.
4. Microinjeção embrionária em estágio unicelular com o complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9
   1. Coloque os embriões em estágio unicelular em uma grade (tecido de náilon de 1 mm) colada em uma placa de Petri de 100 mm preenchida com solução de polissacarose a 3% (Figura 1D).
   2. Usando o microinjetor e sob um estereomicroscópio, injetar 10 nL do complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9 (que corresponde a 500 pg de gRNA duplex + 5 ng de proteína Cas9 por embrião) ou solução controle ao nível do polo animal, na região cortical, logo abaixo da membrana citoplasmática.
      NOTA: A fluoresceína lisina dextran contida na solução permite a classificação subsequente dos embriões injetados.
   3. Transferir os embriões injectados para uma nova placa de Petri de 100 mm contendo uma solução limpa de polissacarose e colocá-los a 21 °C.
   4. No primeiro dia, classifique regularmente os embriões bem desenvolvidos e substitua a solução de polissarose, com 0,1x MBS cerca de 5 h após a microinjeção.
   5. Aguarde 24 h após a injeção para classificar e selecionar embriões rho crispantantes bem injetados em estereomicroscópio fluorescente, visualizando fluoresceína lisina dextran (Figura 1E).
      OBS: Quanto mais precoce a microinjeção após a fecundação, mais eficaz será o nocaute.
5. Criação de embriões e girinos
   1. Criar embriões crocantes em 0,1x MBS em placas de Petri até o estágio 37/38. Remover embriões mortos diariamente e trocar a solução de 0,1x MBS. A partir da fase 37/38, criar os embriões num tanque cheio de água de criação de girinos e, a partir da fase 45, proceder como no passo 2.2.3.

4. Degeneração das células da retina por injeções intraoculares citotóxicas de CoCl ₂

NOTA: Este protocolo é estabelecido para induzir degeneração celular retiniana por injeções intraoculares de cloreto de cobalto (CoCl₂) em girinos de Xenopus laevis . De acordo com a dose, pode desencadear uma degeneração cone-específica ou uma degeneração mais ampla¹⁴. Utilizamos este protocolo em girinos de Xenopus laevis com idade a partir do estágio 48. Também pode ser usado em girinos de Xenopus tropicalis .

1. Preparação de tampão e reagentes
   1. Preparar a solução de benzocaína a 0,005% no momento da utilização como no passo 1.1.
   2. Preparar 100 mM de solução de CoCl₂ adicionando 118,5 mg a 5 ml de 0,1x MBS (ver passo 3.1.4 para preparar 0,1x MBS). Conservar esta solução-mãe durante vários meses a 4 °C, protegida da luz com folha de alumínio.
      CUIDADO: CoCl₂ é classificado como um composto tóxico para a vida humana e animal. Siga cuidadosamente as instruções de manuseio, armazenamento e descarte de resíduos na ficha de dados de segurança.
   3. Para degeneração específica do cone, prepare uma solução de CoCl₂ de 10 mM no momento do uso a partir da solução-mãe de 100 mM diluída em 0,1x MBS. Para uma degeneração celular retiniana mais ampla, prepare uma solução de CoCl₂ de 25 mM.
2. Preparação do sistema de injeção
   1. Afiar os capilares de vidro com um extrator de micropipeta ¹³.
   2. Preencher um capilar afiado com 2-10 μL de solução de CoCl₂ 10 ou 25 mM ou a solução de controle (0,1x MBS) usando uma ponta de microcarregador e colocar o capilar no manipulador do microinjetor.
   3. No maior aumento de um estereomicroscópio, rompa a ponta capilar com pinça fina e ajuste o tempo de injeção (aproximadamente 100 ms) para obter um volume de ejeção de 15-40 nL por pulso. Ajuste a pressão de ejeção para ~40 PSI.
      NOTA: O tamanho da gota deve ser adaptado ao estágio dos girinos e ao tamanho do seu olho. Por exemplo, nos estágios 48-49, o tamanho da gota é ~15-20 nL, enquanto é 30-40 nL nos estágios 52-56. Visualmente, o tamanho da gota é um pouco maior do que o tamanho da lente.
3. Injeções intraoculares de CoCl₂
   1. Use uma rede de mergulho para capturar girinos em seus tanques. Transferir para 50 mL de solução de benzocaína a 0,005%. Aguarde alguns minutos até que os girinos parem de reagir aos estímulos.
      OBS: Vários girinos podem ser anestesiados ao mesmo tempo, mas o tempo gasto no anestésico deve ser inferior a 30 min.
   2. Use uma colher para pegar um girino e coloque-o cuidadosamente em uma pequena placa de Petri (55 mm de diâmetro) contendo um tecido úmido. Posicione a face dorsal do girino para cima no meio da placa de Petri (Figura 1F,G).
   3. Use o microinjetor sob um estereomicroscópio para injetar intraocularmente a solução de CoCl₂ . Insira suavemente o capilar no olho sobre a lente. Quando a ponta capilar estiver dentro do olho, ejete duas gotas por olho. Depois de injetar o olho direito, gire a placa de Petri manualmente 180° para injetar o olho esquerdo.
      NOTA: Certifique-se de que a injeção é feita dentro do olho, portanto, um leve inchaço do olho deve ser visto após cada ejeção da solução. O girino deve ficar fora da água o mínimo possível. A injeção de ambos os olhos deve demorar menos de 1 min.
   4. Transfira o girino injetado para um tanque grande contendo 1 L de água de criação, mergulhando-o cuidadosamente na placa de Petri (Figura 1H). Monitore os girinos até que estejam totalmente despertos.

5. Coloração para avaliar dano retiniano ou degeneração retiniana

1. Fixação e desidratação de girinos
   1. Preparar uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% diluindo 100 ml de solução de PFA a 32% em 700 ml de PBS 1x. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Aliquot esta solução-mãe e conservá-la durante vários meses a -20 °C.
   2. Eutanasiar os girinos em benzocaína a 0,01% e transferi-los para um frasco contendo PFA a 4% por 2 h à temperatura ambiente com agitação ou durante a noite a 4 °C. Enxágue 3 x 5 min em 1x PBS.
   3. Desidratar progressivamente os girinos por incubações sucessivas de 30 min em etanol 70% e 95% (diluído em água tipo II), seguidas de mais três incubações de 1 h em etanol 100%. Conservar as cabeças de girino nesta etapa a -20 °C ou transferi-las diretamente para 100% butanol durante a noite para etapas posteriores.
2. Seccionamento de parafina
   1. Substitua o butanol a 100% por parafina derretida durante 2 h a 62 °C. Substitua a parafina durante 2 x 2 h de incubações adicionais a 62 °C.
   2. Transfira as cabeças dos girinos em moldes descartáveis de embutimento de parafina e oriente-os para que seus olhos estejam bem alinhados e, em seguida, deixe a parafina endurecer. Conservar os blocos à temperatura ambiente.
   3. Corte o excesso de parafina e monte o bloco com o(s) girino(s) embutido(s) no suporte do micrótomo.
   4. Seccionar o bloco com micrótomo na espessura adequada (10-12 μm). Transfira as fitas com seções em uma lâmina previamente coberta com albumina de glicerina a 3% (diluída em água).
   5. Coloque a lâmina em um aquecedor de lâminas a 42 °C por alguns minutos e, em seguida, remova o excesso de albumina de glicerina. Deixe as lâminas secar durante a noite em um forno a 37 °C.
   6. Descermar mergulhando as lâminas por 2 x 15 min em um frasco Coplin preenchido com 100% de xileno. Reidratar as seções com séries graduadas de etanol: 100% duas vezes, 70%, 50% (diluído em água tipo II), ~5 min cada, seguido de 2 x 5 min em água.
3. Marcação por imunofluorescência
   1. Preparar 100 mM de solução-mãe de citrato de sódio (CiNa) adicionando 29,4 g de citrato de sódio sal trissódico di-hidratado (C₆H₅Na₃O₇, 2H₂O) a 1 L de água Tipo II; ajustar o pH para 6 com ácido clorídrico (HCl). Esterilizar em autoclave e armazenar à temperatura ambiente durante vários meses. Preparar a solução desmascaradora no momento da utilização adicionando 25 ml de solução-mãe de CiNa 100 mM a 225 ml de água do tipo II. Adicionar 125 μL de Tween-20 e misturar bem (concentração final é 10 mM CiNa, 0,05% Tween-20).
   2. Preparar a solução-mãe Hoechst a 10 mg/ml adicionando 100 mg de bisBenzimida H 33258 a 10 ml de água tipo I. Conservar esta solução-mãe durante vários meses a 4 °C, protegida da luz com uma folha de alumínio. Preparar a solução Hoechst a 7,5 μg/ml adicionando 300 μL de solução-mãe Hoechst a 400 ml de 1x PBS.
      NOTA: Esta solução pode ser usada até 10 vezes e conservada por cerca de 6 meses a 4 °C, protegida da luz com papel alumínio.
   3. Após a desparafinação dos cortes, realizar a recuperação do antígeno fervendo as seções na solução desmascaradora por 9 min. Deixe a solução esfriar por 20 min.
   4. Enxágue uma vez em água tipo II e uma vez em 1x PBS. Colocar as lâminas planas em uma câmara úmida e adicionar 400-600 μL de solução de bloqueio por lâmina (diluente de anticorpos + Triton X100 a 0,2%) por 30 min.
   5. Substitua a solução de bloqueio por 200 μL por lâmina do anticorpo primário diluído na solução de bloqueio. Use uma lamínula para espalhar a solução sobre as seções, evitando a formação de bolhas. Incubar durante a noite a 4 °C numa câmara húmida.
   6. Transfira as lâminas para um frasco Coplin e enxágue por 3 x 10 min em 1x PBS suplementado com Triton X100 a 0,1%. Colocar as lâminas planas, adicionar 400 μL por lâmina do anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio e deixar durante 2 h à temperatura ambiente numa câmara húmida.
   7. Transfira as lâminas para um frasco Coplin e enxágue por 3 x 5 min com 1x PBS suplementado com Triton X100 a 0,1%.
   8. Contramanchar os núcleos celulares com a solução Hoechst por 10 min e enxaguar 3 x 5 min com 1x PBS.
   9. Coloque lamínulas sobre corrediças em um meio de montagem aquoso projetado especificamente para preservar a fluorescência. Deixe secar por 1 h à temperatura ambiente e guarde-as a 4 °C.
   10. Obtenha imagens das lâminas com um microscópio de fluorescência.
4. Coloração pela hematoxilina e eosina (H&E) para avaliação do dano retiniano
   NOTA: Em vez de marcar um tipo de célula particular por imunomarcação, a histologia geral da retina pode ser avaliada com coloração H&E.
   1. Após a desparafinação dos cortes, realizar a marcação de ácidos nucleicos imergindo as lâminas em solução de hematoxilina por 2 min. Enxágue bem com água da torneira.
   2. Realizar a marcação do citoplasma imergindo as lâminas em solução de eosina a 1% por 1 minuto. Enxágue rapidamente com água.
      NOTA: Eosina é muito solúvel; Se as lâminas forem deixadas muito tempo na água, todo o corante desaparece.
   3. Enxaguar 2 x 5 min em etanol 100% e 2 x 5 min em xileno.
   4. Sob o capô, coloque tampas sobre as corrediças em 4-5 gotas de um meio de montagem. Deixe as lâminas secarem sob um capuz e fotografe no dia seguinte com um microscópio.
5. Detecção de células apoptóticas
   1. Após a desparafinação das secções (ver secção 5.2.6), siga o protocolo do fabricante do kit para detetar a fragmentação do ADN apoptótico.
   2. Realizar a coloração dos núcleos imergindo as lâminas na solução Hoechst (ver secção 5.3.8) e montar com um meio de montagem aquoso especificamente concebido para preservar a fluorescência. Deixe secar por 1 h à temperatura ambiente e guarde-as a 4 °C.
   3. Obtenha imagens das lâminas com um microscópio de fluorescência.

Resultados

Lesão mecânica da retina
Cortes retinianos de girinos submetidos à lesão mecânica descrita no protocolo seção 1 mostram que a lesão retiniana abrange todas as camadas do tecido enquanto permanece limitada ao local da punção (Figura 2A,B).

Ablação condicional de células bastonetes utilizando o sistema NTR-MTZ
Os olhos de girinos transgênicos de Tg(rho:GFP-NTR) anestesiados tratados com ...

Discussão

Vantagens e desvantagens de vários paradigmas de lesão retiniana em girinos Xenopus

Lesão mecânica da retina
Várias lesões cirúrgicas da retina neural foram desenvolvidas em girinos de Xenopus. A retina neural pode ser totalmente removida 15,16 ou apenas parcialmente excisada ^16,17. A lesão mecânica aqui apresentad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325