استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. إلى جانب الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.

Abstract

شبكة الأنابيب الدقيقة هي عنصر أساسي في الجهاز العصبي. ترتبط الطفرات في العديد من البروتينات التنظيمية للأنابيب الدقيقة باضطرابات النمو العصبي والأمراض العصبية ، مثل بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة للأمراض التنكسية العصبية ، وبروتين قطع الأنابيب الدقيقة Spastin و Katanin 60 يسبب الشلل النصفي التشنجي الوراثي وتشوهات النمو العصبي ، على التوالي. يعد الكشف عن شبكات الأنابيب الدقيقة في الخلايا العصبية مفيدا لتوضيح التسبب في الاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإن صغر حجم الخلايا العصبية والترتيب الكثيف لحزم الأنابيب الدقيقة المحورية يجعل تصور شبكات الأنابيب الدقيقة أمرا صعبا. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتشريح الوصلة العصبية العضلية اليرقية وخلايا العضلات ، وكذلك التلوين المناعي لبروتين α-tubulin والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة Futsch لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في ذبابة الفاكهة الميلانية. يسمح لنا التقاطع العصبي العضلي بمراقبة كل من الأنابيب الدقيقة قبل وبعد المشبكي ، ويسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. هنا ، من خلال تحور والإفراط في التعبير عن Katanin 60 في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، ثم فحص شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلة العصبية العضلية وخلايا العضلات ، نكشف بدقة عن الدور التنظيمي ل Katanin 60 في النمو العصبي. لذلك ، جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.

Introduction

تلعب الأنابيب الدقيقة (MTs) ، باعتبارها أحد المكونات الهيكلية للهيكل الخلوي ، دورا مهما في العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك انقسام الخلايا ، ونمو الخلايا وحركتها ، والنقل داخل الخلايا ، والحفاظ على شكل الخلية. يتم تعديل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ووظيفتها من خلال التفاعلات مع البروتينات الأخرى ، مثل MAP1 و MAP2 و Tau و Katanin و Kinesin¹،²،³،^4،5.

في الخلايا العصبية ، الأنابيب الدقيقة ضرورية لتطوير وصيانة المحاور العصبية والتغصنات. تشوهات في الأنابيب الدقيقة تؤدي إلى خلل....

Protocol

1. تشريح اليرقات

ملاحظة: يتم استخدام محلول تشريح محلول ملحي يشبه الدملمف (HL3.1) ¹⁸ ومحلول التثبيت 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) ^19،20في درجة حرارة الغرفة لأن الأنابيب الدقيقة تتبلمر عندما تكون درجة الحرارة منخفضة جدا.

1. اختر يرقة 3 متجولة مع ملقط طويل حاد. اغسله باستخدام HL3.1 وضعه على طبق التشريح تحت المجهر المجسم.
   ملاحظة: يتم التعرف على اليرقة المتجولة 3^{الثالثة} من خلال spiracle الأمامي المتفرع وتزحف حول الأنبوب عند حوالي 96 ساعة (25 درجة مئوية) ²¹.
2. ضع اليرقة مع الجانب الظهري أو ا....

النتائج

لقد أظهرنا إجراء خطوة بخطوة لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة في كل من الوصلات العصبية العضلية (NMJs) وخلايا العضلات. بعد التشريح وفقا للرسم التخطيطي (الشكل 1A-E) ، يتم إجراء تلطيخ مناعي ، ويتم بعد ذلك ملاحظة الصور وتجميعها تحت مجهر ليزر متحد البؤر أو مجهر مضان مجسم (الشكل 1F <.......

Discussion

هنا يتم وصف بروتوكول للتشريح والمناعة من ذبابة الفاكهة اليرقات الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. هناك العديد من النقاط الأساسية التي يجب مراعاتها. أولا ، يعد تجنب إصابة العضلات المرصودة أمرا بالغ الأهمية أثناء عملية التشريح. قد يكون من المفيد إصلاح شرائح اللحم قبل إزالة الأعض?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342