Использование нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы и мышечных клеток для визуализации сети микротрубочек

Резюме

Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Аннотация

Сеть микротрубочек является важным компонентом нервной системы. Мутации во многих регуляторных белках микротрубочек связаны с нарушениями развития нервной системы и неврологическими заболеваниями, например, микротрубочки-ассоциированный белок Tau с нейродегенеративными заболеваниями, расщепляющий микротрубочки белок Spastin и Katanin 60 вызывают наследственную спастическую параплегию и аномалии развития нервной системы, соответственно. Обнаружение сетей микротрубочек в нейронах полезно для выяснения патогенеза неврологических расстройств. Однако небольшой размер нейронов и плотное расположение пучков аксональных микротрубочек затрудняют визуализацию сетей микротрубочек. В данной работе мы описываем метод рассечения нервно-мышечного соединения личинок и мышечных клеток, а также иммуноокрашивание α-тубулина и микротрубочно-ассоциированного белка Futsch для визуализации сетей микротрубочек у Drosophila melanogaster. Нервно-мышечное соединение позволяет нам наблюдать как пре-, так и постсинаптические микротрубочки, а большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Здесь, мутируя и гиперэкспрессируя катанин 60 у Drosophila melanogaster, а затем исследуя сети микротрубочек в нервно-мышечном соединении и мышечных клетках, мы точно выявляем регуляторную роль катанина 60 в развитии нервной системы. Таким образом, в сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек на предмет роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Введение

Микротрубочки (МТ), как один из структурных компонентов цитоскелета, играют важную роль в различных биологических процессах, включая деление клеток, рост и подвижность клеток, внутриклеточный транспорт и поддержание формы клеток. Динамика и функция микротрубочек модулируются взаимодействием с другими белками, такими как MAP1, MAP2, Tau, Katanin и Kinesin 1,2,3,4,5.

В нейронах микротрубочки необходимы для развития и поддержания аксонов и дендритов. Аномалии в микротрубочках приводят к дисфункции и даже гибели нейронов. Например, в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера гиперфосфорилирование тау-белка снижает стабильность сети микротрубочек, вызывая неврологические^{нарушения}. Таким образом, изучение сетей микротрубочек будет способствовать пониманию развития нервной системы и патогенеза неврологических заболеваний.

Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой периферический синапс, образованный между окончанием аксона двигательного нейрона и мышечным волокном, который является превосходной и мощной модельной системой для изучения синаптической структуры и функций⁷. Futsch — белок дрозофилы, гомологичный белку MAP1B, связывающему микротрубочки, обнаруженному у млекопитающих⁸. Он экспрессируется только в нейронах и играет роль в развитии синаптических кнопок NMJ ^8,9. У дикого типа нитевидные пучки, проходящие вдоль центра NMJ, визуализируются путем иммуноокрашивания анти-Futsch. Достигнув конца NMJ, этот пучок имеет способность либо образовывать петлю, состоящую из микротрубочек, либо терять свою нитевидную структуру, что приводит к диффузному и точечному виду¹⁰. Петли микротрубочек связаны с приостановленными конусами роста, что позволяет предположить, что массив микротрубочек стабилен¹¹. Таким образом, мы можем косвенно определить стабильное развитие микротрубочек в NMJ с помощью окрашивания по методу Футча. Большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Факторы, влияющие на стабильность сети микротрубочек, могут быть обнаружены путем анализа плотности и формы микротрубочек. В то же время, состояние сети микротрубочек мышечных клеток может быть перепроверено с результатом NMJ для получения более полных выводов.

Для исследования сети и динамики микротрубочек было использовано множество протоколов. Тем не менее, эти исследования часто сосредотачивались на исследованиях in vitro 12,13,14,15,16. Кроме того, в некоторых экспериментах in vivo использовалась электронная микроскопия для обнаружения цитоскелета¹⁷. В соответствии со специфическим связыванием флуоресцентно меченных антител или химических красителей с белками или ДНК, представленные здесь методы позволяют обнаруживать сети микротрубочек в NMJ на уровне отдельных нейронов in vivo, причем результаты подтверждаются наблюдениями в мышечных клетках. Этот протокол прост, стабилен и воспроизводим в сочетании с мощными генетическими инструментами, доступными у Drosophila melanogaster, что позволяет проводить широкий спектр фенотипических исследований и генетических скринингов на роль регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе in vivo.

протокол

1. Вскрытие личинок

ПРИМЕЧАНИЕ: Рассекающий раствор гемолимфоподобного физиологического раствора (HL3.1)¹⁸ и фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA)^19,20 используются при комнатной температуре^, поскольку микротрубочки деполимеризуются при слишком низкой температуре.

1. Выберите блуждающую личинку^3-го возраста длинными тупыми щипцами. Промойте его HL3.1 и поместите на чашку для препарирования под стереомикроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блуждающая личинка^3-го возраста идентифицируется по разветвленному переднему дыхальцу и ползает по трубке примерно через 96 ч (25 °C)²¹.
2. Расположите личинку спинной или брюшной стороной вверх. Определите дорсальную сторону по двум длинным трахеям, а вентральную — по брюшным зубным поясам.
   1. В зависимости от ткани, которую необходимо исследовать, выберите дорсальную или вентральную диссекцию. Это позволит получить более точное и детальное представление о конкретной интересующей области. Для наблюдения за NMJ и мышечными клетками разрезают спинную и вентральную области личинки соответственно.
3. Приколите рот крючками и хвостиком. Отрегулируйте штифты, чтобы сохранить личинку в вытянутом состоянии. Добавьте в личинку каплю HL3.1, чтобы она не высохла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ca²⁺ -free HL 3.1 можно использовать для минимизации сокращения мышц во время рассечения.
4. С помощью ножниц для рассечения сделайте небольшой поперечный надрез близко к заднему концу, но не отрезайте задний конец. Затем разрезают по вентральной средней линии по направлению к переднему концу.
5. Вставьте четыре булавки в виде насекомых по четырем углам личинки. Отрегулируйте булавки насекомых таким образом, чтобы личинка максимально растянулась во все стороны.
6. Используйте щипцы для удаления внутренних органов, не повреждая при этом мышцы.

2. Фиксация

1. Добавьте 100 мкл PFA (4%), чтобы погрузить туши на 40 минут, пока туши все еще прикреплены к чашке для препарирования.
   ВНИМАНИЕ: Принимаются эффективные меры защиты, чтобы избежать прямого контакта с кожей или вдыхания, так как PFA представляет опасность.
2. Снимите штифты и перенесите образец в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл. Смойте PFA 1x фосфатным буфером физиологического раствора, содержащим 0,2% Triton X-100 (0,2% PBST), чтобы заполнить пробирку микроцентрифуги объемом 2 мл в течение 10 минут на шейкере для обесцвечивания при 15 об/мин. Повторите процесс стирки 5 раз.

3. Иммуноцитохимия

1. Погрузите туши в блокирующее средство (5% козья сыворотка в 0,2% PBST) и блокируйте на 40 мин при комнатной температуре.
2. Удалите блокирующий агент и замените его 200 мкл первичного антитела (например, анти-α-тубулина, 1:1000; анти-Футча, 1:50), разбавленного 0,2% PBST при 4 °C в течение ночи. Визуализируйте мышечные микротрубочки с помощью иммуноокрашивания моноклональным анти-α-тубулином. Anti-Futsch может косвенно отражать морфологию микротрубочек в NMJ.
3. После инкубации первичного антитела личинки промывают 0,2% ПБСТ в течение 10 мин. Повторить 5 раз.
4. Инкубируют личинок с 200 мкл вторичного антитела (например, козьего анти-Мауса-488, 1:1000), разбавленного 0,2% PBST при комнатной температуре, в течение 1,5 ч в темноте.
5. Далее добавляют ядерный краситель типа TO-PRO(R)3 йодида (T3605) в концентрации 1:1000 в инкубационную пробирку на 30 мин при окрашивании микротрубочек в темноте^20,22.
6. Смойте вторичное антитело и ядерный краситель 0,2% PBST в течение 10 мин. Повторите 5 раз в темноте.

4. Монтаж

1. Поместите тушку личинки в 0,2% ПБСТ на предметное стекло и отрегулируйте ее под стереомикроскопом. Убедитесь, что внутренняя поверхность туши личинки обращена вверх, а все тушки личинок расположены так, как нужно.
2. Излишки раствора ПБСТ впитайте салфеткой и аккуратно добавьте каплю монтажного средства против выцветания.
3. Положите на предметное стекло покровный листок, чтобы медленно и осторожно накрыть препарированных личинок, чтобы избежать пузырьков.
4. Нанесите лак для ногтей вокруг покровного стекла. Поместите предметное стекло в темное место, чтобы уменьшить затухание флуоресценции.

5. Получение изображения

1. Для получения изображений используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, выберите 60-кратный масляный иммерсионный объектив (числовая апертура 1,42) или аналогичный и отрегулируйте мощность лазера и длину волны в зависимости от эксперимента.
2. Чтобы идентифицировать NMJ, сделайте снимки в мышце 4 в сегменте A3 (как показано на рисунке 1F). Выберите лазер с длиной волны 488 нм для активации α-тубулина или Футша и 543 нм для активации трека визуализации HRP. Настройте параметры на размер кадра 800 x 800 пикселей, цифровой зум 2,0 и интервал изображения 0,8 мкм в NMJ (рис. 2).
3. Чтобы идентифицировать микротрубочки в мышце, сделайте снимки мышцы 2 в сегменте A3-A5 (как показано на рисунке 1G), так как у нее меньше трахеальных ветвей. Выберите лазер с длиной волны 488 нм для активации α-тубулина и лазер с длиной волны 635 нм для активации трека визуализации T3605. Настройте параметры на размер кадра 1024 x 1024 пикселя, цифровой зум 3,0 и интервал визуализации 0,4 мкм в мышечных клетках (рис. 3).

Результаты

Мы продемонстрировали пошаговую процедуру визуализации сети микротрубочек как в нервно-мышечных соединениях (NMJ), так и в мышечных клетках. После вскрытия в соответствии с принципиальной схемой (рис. 1A-E) проводится иммуноокрашивание, после чего изображения наблюдаются и собир...

Обсуждение

Здесь описан протокол вскрытия и иммуноокрашивания нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы и мышечных клеток. Есть несколько важных моментов, которые следует учитывать. Во-первых, во время процесса рассечения очень важно избежать травмирования наблюдаемых мышц. Возможно, с?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342