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요약

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초록

미세소관 네트워크는 신경계의 필수 구성 요소입니다. 많은 미세소관 조절 단백질의 돌연변이는 신경퇴행성 질환에 대한 미세소관 관련 단백질 타우(Tau), 미세소관 절단 단백질 스파스틴(Spastin) 및 카타닌 60(Katanin 60)과 같은 신경 발달 장애 및 신경 발달 질환과 관련이 있습니다. 뉴런에서 미세소관 네트워크를 검출하는 것은 신경 장애의 발병 기전을 밝히는 데 유리합니다. 그러나 뉴런의 크기가 작고 축삭 미세소관 다발이 조밀하게 배열되어 있어 미세소관 네트워크를 시각화하는 것이 어렵습니다. 이 연구에서는 유충 신경근 접합부와 근육 세포의 해부 방법과 α-튜불린 및 미세소관 관련 단백질 Futsch의 면역염색을 통해 Drosophila melanogaster의 미세소관 네트워크를 시각화하는 방법을 설명합니다. 신경근 접합부는 시냅스 전후 미세소관을 모두 관찰할 수 있게 해주며, 초파리 유충의 근육 세포는 크기가 커서 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서 카타닌 60을 돌연변이시키고 과발현시킨 다음 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 조사하여 신경 발달에서 카타닌 60의 조절 역할을 정확하게 밝힙니다. 그러므로, Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합해, 이 의정서는 매우 신경계에 있는 microtubule 네트워크 통제 단백질의 역할을 위한 유전자 검열 그리고 microtubule 역동성 분석을 촉진합니다.

서문

미세소관(MT)은 세포골격의 구조적 구성 요소 중 하나로서 세포 분열, 세포 성장 및 운동성, 세포 내 수송, 세포 모양 유지 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미세소관의 역학 및 기능은 MAP1, MAP2, Tau, Katanin 및 Kinesin 1,2,3,4,5와 같은 다른 단백질과의 상호 작용에 의해 조절됩니다.

뉴런에서 미세소관은 축삭돌기와 수상돌기의 발달과 유지에 필수적입니다. 미세소관의 이상은 기능 장애와 심지어 뉴런의 죽음으로 이어집니다. 예를 들어, 알츠하이머 환자의 뇌에서 타우 단백질 과인산화는 미세소관 네트워크의 안정성을 감소시켜 신경학적 불규칙성을 유발한다6. 따라서 미세소관 네트워크를 검사하는 것은 신경 발달과 신경 질환의 발병 기전을 이해하는 데 기여할 것입니다.

신경근 접합부(NMJ)는 운동 뉴런 축삭 말단과 근육 섬유 사이에 형성된 말초 시냅스로, 시냅스 구조와 기능을 연구하기 위한 우수하고 강력한 모델 시스템이다7. Futsch는 포유류에서 발견되는 미세소관 결합 단백질 MAP1B와 상동적인 초파리의 단백질입니다8. 그것은 뉴런에서만 발현되며 NMJ의 시냅스 버튼 8,9의 발달에 중요한 역할을합니다. 야생형에서 NMJ 공정의 중심을 따라 흐르는 사상 다발은 anti-Futsch를 사용한 면역염색을 통해 시각화됩니다. NMJ의 말단에 도달하면, 이 다발은 미세소관으로 구성된 고리를 형성하거나 사상 구조를 잃게 되어, 확산 및 반점 모양(10)을 형성할 수 있다. 미세소관 고리는 일시 중지된 성장 원뿔과 관련이 있으며, 이는 미세소관 배열이 안정적임을 시사한다11. 따라서 Futsch 염색을 통해 NMJ에서 안정적인 미세소관 발달을 간접적으로 확인할 수 있습니다. 초파리 유충의 근육 세포의 크기가 크기 때문에 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 미세소관 네트워크의 안정성에 영향을 미치는 요인은 미세소관의 밀도와 모양을 분석하여 찾을 수 있습니다. 동시에 근육 세포의 미세소관 네트워크 상태를 NMJ 결과와 교차 검증하여 보다 포괄적인 결론을 얻을 수 있습니다.

미세소관의 네트워크와 역학을 조사하기 위해 많은 프로토콜이 사용되었습니다. 그러나, 이러한 연구들은 종종 시험관 내 연구(in vitro studies)12,13,14,15,16에 초점을 맞추었다. 대안적으로, 일부 생체내 실험은 세포골격(17)을 검출하기 위해 전자 현미경을 이용하였다. 형광 표지된 항체 또는 화학 염료가 단백질 또는 DNA에 특이적으로 결합하는 것에 따르면, 여기에 제시된 방법을 사용하면 생체 내 개별 뉴런 수준에서 NMJ의 미세소관 네트워크를 검출할 수 있으며, 결과는 근육 세포의 관찰에 의해 확증됩니다. 이 프로토콜은 Drosophila melanogaster에서 사용할 수 있는 강력한 유전 도구와 결합할 때 간단하고 안정적이며 반복 가능하여 생체 내 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 다양한 표현형 검사 및 유전자 스크리닝을 가능하게 합니다.

프로토콜

1. 유충 해부

알림: 해부 용액 혈림프 유사 식염수(HL3.1)18 및 고정 용액 4% 파라포름알데히드(PFA)19,20은 온도가 너무 낮을 때 미세소관이 해중합되기 때문에 실온에서 사용됩니다.

  1. 길고 뭉툭한 집게로 방황하는 3번째 인스타 유충을 골라냅니다. HL3.1로 세척하고 실체현미경 아래의 해부 접시에 놓습니다.
    참고: 방황하는 3번째 인스타 유충은 분지된 전방 나선으로 식별되며 약 96시간(25°C)21에서 튜브 주위를 기어 다닙니다.
  2. 등쪽이나 배쪽이 위로 향하도록 유충을 배치합니다. 두 개의 긴 기관으로 등쪽을 식별하고 복부 치아 벨트로 복부를 식별합니다.
    1. 관찰할 조직에 따라 등쪽 또는 복부 절개를 선택하십시오. 이렇게 하면 특정 관심 영역을 보다 정확하고 자세하게 볼 수 있습니다. NMJ 및 근육 세포 관찰을 위해 유충 등쪽과 복부 부위를 각각 절개합니다.
  3. 입 고리와 꼬리를 고정합니다. 핀을 조정하여 유충을 확장된 상태로 유지합니다. HL3.1 한 방울을 유충에 떨어뜨려 유충이 마르지 않도록 합니다.
    알림: Ca2+ -free HL 3.1은 해부 중 근육 수축을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다.
  4. 해부 가위를 사용하여 뒤쪽 끝 가까이에 작은 가로 절단을 하되 뒤쪽 끝을 자르지 마십시오. 그런 다음 복부 정중선을 따라 앞쪽 끝을 향해 자릅니다.
  5. 유충의 네 모서리에 4 개의 곤충 핀을 삽입하십시오. 유충이 모든 방향으로 최대한 늘어나도록 곤충 핀을 다시 조정하십시오.
  6. 집게를 사용하여 근육을 손상시키지 않으면서 내부 장기를 제거합니다.

2. 고정

  1. 100μL의 PFA(4%)를 추가하여 사체가 해부 접시에 고정되어 있는 동안 사체를 40분 동안 담그십시오.
    주의 : PFA는 위험하므로 피부와의 직접적인 접촉이나 흡입을 피하기 위해 효과적인 보호 조치를 취합니다.
  2. 핀을 분리하고 샘플을 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 0.2% Triton X-100(0.2% PBST)을 함유한 1x 인산염 완충 식염수로 PFA를 헹구어 15rpm의 탈색 셰이커에서 10분 동안 2mL 미세 원심분리기 튜브를 채웁니다. 세탁 과정을 5회 반복합니다.

3. 면역세포화학

  1. 사체를 차단제(0.2% PBST에 5% 염소 혈청)에 담그고 실온에서 40분 동안 차단합니다.
  2. 차단제를 제거하고 4°C에서 밤새 0.2% PBST로 희석한 200μL의 1차 항체(예: anti-α-tubulin, 1:1000; anti-Futsch, 1:50)로 교체합니다. 단클론 항α-튜불린(anti--tubulin)으로 면역염색을 통해 근육 미세소관을 시각화합니다. Anti-Futsch는 NMJ의 미세소관 형태를 간접적으로 반영할 수 있습니다.
  3. 1차 항체를 배양한 후 0.2% PBST로 유충을 10분 동안 세척하고 5회 반복합니다.
  4. 0.2% PBST로 희석한 200μL의 2차 항체(예: goat anti-Mouse-488, 1:1000)로 유충을 어두운 곳에서 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다.
  5. 다음으로, 어두운 곳에서 미세소관을 염색할 때 3605:1000 농도의 TO-PRO(R) 3 요오드화물(T20,22)과 같은 핵 염료를 배양 튜브에 추가합니다.
  6. 2차 항체와 핵 염료를 0.2% PBST로 10분 동안 헹굽니다. 어둠 속에서 5회 반복합니다.

4. 장착

  1. 유충 사체를 유리 슬라이드에 0.2% PBST로 놓고 실체현미경으로 조정합니다. 유충 사체의 내부 표면이 위를 향하고 모든 유충 사체가 원하는 대로 배열되었는지 확인하십시오.
  2. 물티슈로 과도한 PBST 용액을 흡수하고 페이드 방지 장착 매체를 부드럽게 추가합니다.
  3. 슬라이드에 커버슬립을 놓아 해부된 유충을 천천히 부드럽게 덮어 기포가 생기지 않도록 합니다.
  4. 커버슬립 주위에 손톱 광택제를 바릅니다. 형광 감쇠를 줄이기 위해 슬라이드를 어두운 공간에 놓으십시오.

5. 이미지 취득

  1. 이미지를 획득하려면 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 60x 오일 이멀젼 대물렌즈(개구수 1.42) 또는 이와 유사한 것을 선택하고 실험에 따라 레이저 출력과 파장을 조정합니다.
  2. NMJ를 식별하려면 세그먼트 A4의 근육 3에서 이미지를 캡처합니다( 그림 1F의 위치 참조). 488nm 레이저를 선택하여 α-tubulin 또는 Futsch를 활성화하고 543nm를 선택하여 HRP 이미징 트랙을 활성화합니다. 파라미터를 800픽셀 x 800픽셀의 프레임 크기, 2.0의 디지털 줌, 0.8μm의 이미징 간격(NMJ)으로 조정합니다(그림 2).
  3. 근육의 미세소관을 식별하려면 기관 가지가 더 적기 때문에 세그먼트 A3-A5( 그림 1G의 위치 참조)에서 근육 2의 이미지를 캡처합니다. α-튜불린을 활성화하기 위해 488nm 레이저를 선택하고 T3605 이미징 트랙을 활성화하기 위해 635nm 레이저를 선택하십시오. 파라미터를 1024픽셀 x 1024픽셀의 프레임 크기, 3.0의 디지털 줌, 근육 세포의 이미징 간격 0.4μm로 조정합니다(그림 3).

결과

우리는 신경근 접합부(NMJ)와 근육 세포 모두에서 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 단계별 절차를 시연했습니다. 개략도(그림 1A-E)에 따라 해부한 후 면역염색을 수행하고 레이저 컨포칼 현미경 또는 입체 형광 현미경(그림 1F,G)으로 이미지를 관찰 및 수집합니다.

NMJ의 시냅스 전후 미세소관 조직 모두...

토론

여기에서는 초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포의 해부 및 면역염색을 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 고려해야 할 몇 가지 필수 사항이 있습니다. 첫째, 관찰된 근육의 부상을 피하는 것은 해부 과정에서 매우 중요합니다. 집게와 근육 사이의 직접적인 접촉을 방지하기 위해 내부 장기를 제거하기 전에 필렛을 고정하는 것이 좋습니다. 근육 손상이나 유충 표피로부터의 분리를 ?...

공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

원고에 대한 토론과 논평을 해주신 Ying Xiong 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립과학재단(NSFC)이 C. M.(31500839)에 제공한 보조금으로 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidininvitrogenA30104dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting MediumBeyotimeP0128M
FV10-ASW confocal microscopeOlympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugatedThermo FisherA-11001dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710Zeiss
Micro Scissors66vision54138B
Mouse anti-Futsch antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank  22C10dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibodySigmaT5168dilute 1:1,000
ParaformaldehydeWako168-20955Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien PinsEntomoravia0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRPJackson ImmunoResearchdilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodideInvitrogenT3605dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8Kylin-Bell lab instrumentsE0018
TritonX-100BioFroxx1139
Tweezers dumont500342

참고문헌

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