초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

요약

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초록

미세소관 네트워크는 신경계의 필수 구성 요소입니다. 많은 미세소관 조절 단백질의 돌연변이는 신경퇴행성 질환에 대한 미세소관 관련 단백질 타우(Tau), 미세소관 절단 단백질 스파스틴(Spastin) 및 카타닌 60(Katanin 60)과 같은 신경 발달 장애 및 신경 발달 질환과 관련이 있습니다. 뉴런에서 미세소관 네트워크를 검출하는 것은 신경 장애의 발병 기전을 밝히는 데 유리합니다. 그러나 뉴런의 크기가 작고 축삭 미세소관 다발이 조밀하게 배열되어 있어 미세소관 네트워크를 시각화하는 것이 어렵습니다. 이 연구에서는 유충 신경근 접합부와 근육 세포의 해부 방법과 α-튜불린 및 미세소관 관련 단백질 Futsch의 면역염색을 통해 Drosophila melanogaster의 미세소관 네트워크를 시각화하는 방법을 설명합니다. 신경근 접합부는 시냅스 전후 미세소관을 모두 관찰할 수 있게 해주며, 초파리 유충의 근육 세포는 크기가 커서 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서 카타닌 60을 돌연변이시키고 과발현시킨 다음 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 조사하여 신경 발달에서 카타닌 60의 조절 역할을 정확하게 밝힙니다. 그러므로, Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합해, 이 의정서는 매우 신경계에 있는 microtubule 네트워크 통제 단백질의 역할을 위한 유전자 검열 그리고 microtubule 역동성 분석을 촉진합니다.

서문

미세소관(MT)은 세포골격의 구조적 구성 요소 중 하나로서 세포 분열, 세포 성장 및 운동성, 세포 내 수송, 세포 모양 유지 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미세소관의 역학 및 기능은 MAP1, MAP2, Tau, Katanin 및 Kinesin 1,2,3,4,5와 같은 다른 단백질과의 상호 작용에 의해 조절됩니다.

뉴런에서 미세소관은 축삭돌기와 수상돌기의 발달과 유지에 필수적입니다. 미세소관의 이상은 기능 장애와 심지어 뉴런의 죽음으로 이어집니다. 예를 들어, 알츠하이머 환자의 뇌에서 타우 단백질 과인산화는 미세소관 네트워크의 안정성을 감소시켜 신경학적 불규칙성을 유발한다⁶. 따라서 미세소관 네트워크를 검사하는 것은 신경 발달과 신경 질환의 발병 기전을 이해하는 데 기여할 것입니다.

신경근 접합부(NMJ)는 운동 뉴런 축삭 말단과 근육 섬유....

프로토콜

1. 유충 해부

알림: 해부 용액 혈림프 유사 식염수(HL3.1)¹⁸ 및 고정 용액 4% 파라포름알데히드(PFA)^19,20은 온도가 너무 낮을 때 미세소관이 해중합되기 때문에 실온에서 사용됩니다.

1. 길고 뭉툭한 집게로 방황하는 3^번째 인스타 유충을 골라냅니다. HL3.1로 세척하고 실체현미경 아래의 해부 접시에 놓습니다.
   참고: 방황하는 3^번째 인스타 유충은 분지된 전방 나선으로 식별되며 약 96시간(25°C)²¹에서 튜브 주위를 기어 다닙니다.
2. 등쪽이나 배쪽이 위로 향하도록 유충을 배치합니다. 두 개의 긴 기관으로 등쪽을 식별하고 복부 치아 벨트로 복부를 식별합니다.
   1. 관찰할 조직에 따라 등쪽 또는 복부 절개를 선택하십시오. 이렇게 하면 특정 관심 영역을 보다 정확하고 자세하게 볼 수 있습니다. NMJ 및 근육 세포 관찰을 위해 유충 등쪽과 복부 부위를 각각 절개합니다.
3. 입 고리와 꼬리를 고정합니....

토론

여기에서는 초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포의 해부 및 면역염색을 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 고려해야 할 몇 가지 필수 사항이 있습니다. 첫째, 관찰된 근육의 부상을 피하는 것은 해부 과정에서 매우 중요합니다. 집게와 근육 사이의 직접적인 접촉을 방지하기 위해 내부 장기를 제거하기 전에 필렛을 고정하는 것이 좋습니다. 근육 손상이나 유충 표피로부터의 분리를 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342