Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Zusammenfassung

Das Mikrotubuli-Netzwerk ist ein wesentlicher Bestandteil des Nervensystems. Mutationen in vielen Mikrotubuli-regulatorischen Proteinen werden mit neurologischen Entwicklungsstörungen und neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie z. B. das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau zu neurodegenerativen Erkrankungen, Mikrotubuli-durchtrennende Proteine Spastin und Katanin 60 verursachen erbliche spastische Querschnittslähmung bzw. neurologische Entwicklungsstörungen. Der Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken in Neuronen ist vorteilhaft für die Aufklärung der Pathogenese neurologischer Erkrankungen. Die geringe Größe der Neuronen und die dichte Anordnung der axonalen Mikrotubuli-Bündel machen die Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke jedoch schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Dissektion der neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen der Larve sowie zur Immunfärbung von α-Tubulin und dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Futsch zur Visualisierung von Mikrotubuli-Netzwerken in Drosophila melanogaster. Die neuromuskuläre Verbindung ermöglicht es uns, sowohl prä- als auch postsynaptische Mikrotubuli zu beobachten, und die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Durch die Mutation und Überexpression von Katanin 60 in Drosophila melanogaster und die anschließende Untersuchung der Mikrotubuli-Netzwerke in der neuromuskulären Verbindung und den Muskelzellen zeigen wir die regulatorische Rolle von Katanin 60 in der Neuroentwicklung genau auf. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll daher das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Einleitung

Mikrotubuli (MTs) spielen als einer der strukturellen Bestandteile des Zytoskeletts eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Prozessen, darunter Zellteilung, Zellwachstum und -motilität, intrazellulärer Transport und die Aufrechterhaltung der Zellform. Die Dynamik und Funktion der Mikrotubuli wird durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen wie MAP1, MAP2, Tau, Katanin und Kinesin 1,2,3,4,5 moduliert.

In Neuronen sind Mikrotubuli essentiell für die Entwicklung und Aufr....

Protokoll

1. Sektion der Larven

HINWEIS: Die Präparierlösung Hämolymph-ähnliche Kochsalzlösung (HL3.1)¹⁸ und die Fixierlösung 4% Paraformaldehyd (PFA)^19,20 werden bei Raumtemperatur verwendet, da die Mikrotubuli bei zu niedriger Temperatur depolymerisieren.

1. Suchen Sie sich eine wandernde Larve des 3. Instars mit einer langen, stumpfen Zange aus^. Waschen Sie es mit HL3.1 und legen Sie es auf die Sezierschale unter dem Stereomikroskop.
   HINWEIS: Die wandernde Larve des 3. Instars wird durch eine verzweigte vordere Spirakel identifi....

Diskussion

Hier wird ein Protokoll für die Dissektion und Immunfärbung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven beschrieben. Es gibt mehrere wesentliche Punkte zu beachten. Erstens ist es entscheidend, Verletzungen der beobachteten Muskeln während des Sezierprozesses zu vermeiden. Es kann sich lohnen, das Filet vor der Entfernung der inneren Organe zu fixieren, um einen direkten Kontakt zwischen der Zange und den Muskeln zu verhindern. Um Muskelschäden oder eine Trennung von der Epidermi.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342