Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Zusammenfassung

Das Mikrotubuli-Netzwerk ist ein wesentlicher Bestandteil des Nervensystems. Mutationen in vielen Mikrotubuli-regulatorischen Proteinen werden mit neurologischen Entwicklungsstörungen und neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie z. B. das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau zu neurodegenerativen Erkrankungen, Mikrotubuli-durchtrennende Proteine Spastin und Katanin 60 verursachen erbliche spastische Querschnittslähmung bzw. neurologische Entwicklungsstörungen. Der Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken in Neuronen ist vorteilhaft für die Aufklärung der Pathogenese neurologischer Erkrankungen. Die geringe Größe der Neuronen und die dichte Anordnung der axonalen Mikrotubuli-Bündel machen die Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke jedoch schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Dissektion der neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen der Larve sowie zur Immunfärbung von α-Tubulin und dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Futsch zur Visualisierung von Mikrotubuli-Netzwerken in Drosophila melanogaster. Die neuromuskuläre Verbindung ermöglicht es uns, sowohl prä- als auch postsynaptische Mikrotubuli zu beobachten, und die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Durch die Mutation und Überexpression von Katanin 60 in Drosophila melanogaster und die anschließende Untersuchung der Mikrotubuli-Netzwerke in der neuromuskulären Verbindung und den Muskelzellen zeigen wir die regulatorische Rolle von Katanin 60 in der Neuroentwicklung genau auf. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll daher das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Einleitung

Mikrotubuli (MTs) spielen als einer der strukturellen Bestandteile des Zytoskeletts eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Prozessen, darunter Zellteilung, Zellwachstum und -motilität, intrazellulärer Transport und die Aufrechterhaltung der Zellform. Die Dynamik und Funktion der Mikrotubuli wird durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen wie MAP1, MAP2, Tau, Katanin und Kinesin 1,2,3,4,5 moduliert.

In Neuronen sind Mikrotubuli essentiell für die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Axonen und Dendriten. Anomalien in den Mikrotubuli führen zu Funktionsstörungen und sogar zum Absterben von Neuronen. Im Gehirn von Alzheimer-Patienten verringert beispielsweise die Hyperphosphorylierung des Tau-Proteins die Stabilität des Mikrotubuli-Netzwerks, was zu neurologischen Unregelmäßigkeiten führt⁶. Die Untersuchung von Mikrotubuli-Netzwerken wird somit zum Verständnis der neuronalen Entwicklung und der Pathogenese neurologischer Erkrankungen beitragen.

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die periphere Synapse, die zwischen einem Axonterminal des Motoneurons und einer Muskelfaser gebildet wird, was ein hervorragendes und leistungsfähiges Modellsystem für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktionen darstellt⁷. Futsch ist ein Protein in Drosophila, das homolog zum Mikrotubuli-bindenden Protein MAP1B ist, das in Säugetieren vorkommt⁸. Es wird nur in Neuronen exprimiert und spielt eine Rolle bei der Entwicklung der synaptischen Knöpfe des NMJ ^8,9. Im Wildtyp werden filamentöse Bündel, die entlang des Zentrums von NMJ-Prozessen verlaufen, durch Immunfärbung mit Anti-Futsch sichtbar gemacht. Wenn dieses Bündel das Ende von NMJ erreicht, hat es die Fähigkeit, entweder eine Schleife aus Mikrotubuli zu bilden oder seine filamentöse Struktur zu verlieren, was zu einem diffusen und punktförmigen Erscheinungsbild führt¹⁰. Mikrotubuli-Schleifen sind mit pausierten Wachstumskegeln assoziiert, was darauf hindeutet, dass das Mikrotubuli-Array stabil ist¹¹. Daher können wir indirekt die stabile Mikrotubuli-Entwicklung im NMJ durch Futsch-Färbung bestimmen. Die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Die Faktoren, die die Stabilität des Mikrotubuli-Netzwerks beeinflussen, können durch die Analyse der Dichte und Form der Mikrotubuli ermittelt werden. Gleichzeitig kann der Status des Mikrotubuli-Netzwerks von Muskelzellen mit dem Ergebnis der NMJ abgeglichen werden, um umfassendere Schlussfolgerungen zu erhalten.

Viele Protokolle wurden verwendet, um das Netzwerk und die Dynamik von Mikrotubuli zu untersuchen. Diese Forschungen konzentrierten sich jedoch häufig auf In-vitro-Studien 12,13,14,15,16. Alternativ wurden in einigen In-vivo-Experimenten Elektronenmikroskopie eingesetzt, um das Zytoskelett zu detektieren¹⁷. Entsprechend der spezifischen Bindung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder chemischen Farbstoffen an Proteine oder DNA erlauben die hier vorgestellten Methoden den Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken im NMJ auf der Ebene einzelner Neuronen in vivo, wobei die Ergebnisse durch Beobachtungen in Muskelzellen bestätigt werden. Dieses Protokoll ist einfach, stabil und wiederholbar, wenn es mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen kombiniert wird, die in Drosophila melanogaster verfügbar sind, und ermöglicht eine Vielzahl von phänotypischen Untersuchungen und genetischen Screenings für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem in vivo.

Protokoll

1. Sektion der Larven

HINWEIS: Die Präparierlösung Hämolymph-ähnliche Kochsalzlösung (HL3.1)¹⁸ und die Fixierlösung 4% Paraformaldehyd (PFA)^19,20 werden bei Raumtemperatur verwendet, da die Mikrotubuli bei zu niedriger Temperatur depolymerisieren.

1. Suchen Sie sich eine wandernde Larve des 3. Instars mit einer langen, stumpfen Zange aus^. Waschen Sie es mit HL3.1 und legen Sie es auf die Sezierschale unter dem Stereomikroskop.
   HINWEIS: Die wandernde Larve des 3. Instars wird durch eine verzweigte vordere Spirakel identifiziert und krabbelt bei ca. 96 h (25 °C) um die Röhre ^herum21.
2. Positionieren Sie die Larve mit der dorsalen oder ventralen Seite nach oben. Identifizieren Sie die dorsale Seite durch die beiden langen Luftröhren und die ventrale durch die abdominalen Dentikelgürtel.
   1. Je nachdem, welches Gewebe beobachtet werden soll, entscheiden Sie sich für eine dorsale oder ventrale Dissektion. Dies ermöglicht eine genauere und detailliertere Sicht auf den spezifischen Interessenbereich. Für die NMJ- und Muskelzellbeobachtung werden die dorsalen bzw. ventralen Regionen der Larven aufgeschnitten.
3. Stecken Sie die Maulhaken und den Schwanz fest. Passen Sie die Stifte an, um die Larve in einem verlängerten Zustand zu halten. Geben Sie einen Tropfen HL3.1 in die Larve, um sie vor dem Austrocknen zu bewahren.
   HINWEIS: Ca²⁺ -freies HL 3.1 kann verwendet werden, um die Kontraktion der Muskeln während der Dissektion zu minimieren.
4. Mit der Präparierschere einen kleinen Querschnitt in der Nähe des hinteren Endes machen, aber nicht das hintere Ende. Schneiden Sie dann entlang der ventralen Mittellinie in Richtung des vorderen Endes.
5. Setze vier Insektennadeln an den vier Ecken der Larve ein. Stellen Sie die Insektennadeln so ein, dass die Larve maximal in alle Richtungen gestreckt wird.
6. Verwenden Sie die Pinzette, um innere Organe zu entfernen, ohne die Muskeln zu beschädigen.

2. Fixierung

1. Fügen Sie 100 μl PFA (4 %) hinzu, um die Schlachtkörper 40 Minuten lang einzutauchen, während die Schlachtkörper noch auf der Präparierschale stecken.
   VORSICHT: Es werden wirksame Schutzmaßnahmen ergriffen, um den direkten Kontakt mit der Haut oder das Einatmen zu vermeiden, da PFA eine Gefahr darstellt.
2. Demontieren Sie die Stifte und geben Sie die Probe in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Spülen Sie PFA mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung ab, die 0,2 % Triton X-100 (0,2 % PBST) enthält, um das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 10 Minuten lang auf dem Entfärbungsschüttler bei 15 U/min zu füllen. Wiederholen Sie den Waschvorgang 5x.

3. Immunzytochemie

1. Die Schlachtkörper in Blockmittel (5 % Ziegenserum in 0,2 % PBST) tauchen und 40 Minuten bei Raumtemperatur blocken.
2. Entfernen Sie das Blockierungsmittel und ersetzen Sie es durch 200 μl des Primärantikörpers (z. B. Anti-α-Tubulin, 1:1000; Anti-Futsch, 1:50), verdünnt mit 0,2 % PBST bei 4 °C über Nacht. Visualisieren Sie Muskelmikrotubuli durch Immunfärbung mit monoklonalem Anti-α-Tubulin. Anti-Futsch kann indirekt die Mikrotubuli-Morphologie im NMJ widerspiegeln.
3. Nach Inkubation des Primärantikörpers die Larven 10 Minuten lang mit 0,2 % PBST waschen. 5x wiederholen.
4. Die Larven werden mit 200 μl Sekundärantikörper (z. B. Ziegen-Anti-Maus-488, 1:1000), verdünnt mit 0,2 % PBST bei Raumtemperatur für 1,5 h im Dunkeln inkubiert.
5. Als nächstes wird ein Kernfarbstoff wie TO-PRO(R) 3-Iodid (T3605) in einer Konzentration von 1:1000 für 30 Minuten in das Inkubationsröhrchen gegeben^, während die Mikrotubuli im Dunkeln^{gefärbt werden 20,22}.
6. Spülen Sie den sekundären Antikörper und den Kernfarbstoff mit 0,2 % PBST für 10 Minuten ab. Wiederholen Sie dies 5x im Dunkeln.

4. Montage

1. Legen Sie den Larvenkadaver in 0,2 % PBST auf einen Objektträger und justieren Sie ihn unter dem Stereomikroskop. Achten Sie darauf, dass die Innenfläche des Larvenkadavers nach oben zeigt und alle Larvenkadaver wie gewünscht angeordnet sind.
2. Nehmen Sie überschüssige PBST-Lösung mit einem Tuch auf und fügen Sie vorsichtig einen Tropfen Anti-Fade-Eindeckmittel hinzu.
3. Legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger, um die präparierten Larven langsam und vorsichtig abzudecken, um Blasen zu vermeiden.
4. Tragen Sie Fingernagellack um das Deckglas herum auf. Platzieren Sie das Objektträger im dunklen Raum, um die Fluoreszenzdämpfung zu reduzieren.

5. Bildaufnahme

1. Um die Bilder aufzunehmen, verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, wählen Sie das 60-fache Ölimmersionsobjektiv (numerische Apertur 1,42) oder ein ähnliches und passen Sie die Laserleistung und Wellenlänge basierend auf dem Experiment an.
2. Um das NMJ zu identifizieren, nehmen Sie Bilder in Muskel 4 im Segment A3 auf (wie in Abbildung 1F dargestellt). Wählen Sie einen 488-nm-Laser, um das α-Tubulin oder Futsch zu aktivieren, und 543 nm, um die HRP-Bildgebungsspur zu aktivieren. Stellen Sie die Parameter auf eine Bildgröße von 800 x 800 Pixeln, einen Digitalzoom von 2,0 und ein Abbildungsintervall von 0,8 μm in NMJs ein (Abbildung 2).
3. Um die Mikrotubuli im Muskel zu identifizieren, nehmen Sie Bilder von Muskel 2 in den Segmenten A3-A5 auf (wie in Abbildung 1G dargestellt), da er weniger Trachealäste aufweist. Wählen Sie einen 488-nm-Laser zur Aktivierung von α-Tubulin und einen 635-nm-Laser zur Aktivierung der T3605-Bildgebungsspur. Stellen Sie die Parameter auf eine Bildgröße von 1024 x 1024 Pixeln, einen Digitalzoom von 3,0 und ein Abbildungsintervall von 0,4 μm in Muskelzellen ein (Abbildung 3).

Ergebnisse

Wir demonstrierten ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks sowohl in neuromuskulären Verbindungen (NMJs) als auch in Muskelzellen. Nach der Dissektion gemäß dem schematischen Diagramm (Abbildung 1A-E) wird eine Immunfärbung durchgeführt, und anschließend werden die Bilder unter einem konfokalen Lasermikroskop oder einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop beobachtet und gesammelt (Abbildung 1F,G).

Diskussion

Hier wird ein Protokoll für die Dissektion und Immunfärbung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven beschrieben. Es gibt mehrere wesentliche Punkte zu beachten. Erstens ist es entscheidend, Verletzungen der beobachteten Muskeln während des Sezierprozesses zu vermeiden. Es kann sich lohnen, das Filet vor der Entfernung der inneren Organe zu fixieren, um einen direkten Kontakt zwischen der Zange und den Muskeln zu verhindern. Um Muskelschäden oder eine Trennung von der Epidermi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342