使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞可视化微管网络

摘要

在这里，我们提出了一个详细的方案来可视化神经肌肉接头和肌肉细胞中的微管网络。结合 黑腹果蝇强大的遗传工具，该方案极大地促进了微管网络调节蛋白在神经系统中的作用的遗传筛选和微管动力学分析。

摘要

微管网络是神经系统的重要组成部分。许多微管调节蛋白的突变与神经发育障碍和神经系统疾病有关，如微管相关蛋白Tau对神经退行性疾病，微管切断蛋白Spastin和Katanin 60分别引起遗传性痉挛性截瘫和神经发育异常。检测神经元中的微管网络有利于阐明神经系统疾病的发病机制。然而，神经元的小尺寸和轴突微管束的密集排列使得微管网络的可视化具有挑战性。在这项研究中，我们描述了一种解剖幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞的方法，以及α-微管蛋白和微管相关蛋白Futsch的免疫染色，以可视化果蝇中的微管网络。神经肌肉接头使我们能够观察突触前和突触后的微管，果蝇幼虫中大尺寸的肌肉细胞可以清晰地观察微管网络。在这里，通过在黑腹果蝇中突变和过表达Katanin 60，然后检查神经肌肉接头和肌肉细胞中的微管网络，我们准确地揭示了Katanin 60在神经发育中的调节作用。因此，结合果蝇黑腹果蝇强大的遗传工具，该方案极大地促进了微管网络调节蛋白在神经系统中的作用的遗传筛选和微管动力学分析。

引言

微管（MTs）作为细胞骨架的结构成分之一，在细胞分裂、细胞生长和运动、细胞内运输和维持细胞形状等多种生物过程中发挥着重要作用。微管动力学和功能通过与其他蛋白质的相互作用进行调节，例如 MAP1、MAP2、Tau、Katanin 和驱动蛋白 1,2,3,4,5。

在神经元中，微管对于轴突和树突的发育和维持至关重要。微管异常会导致功能障碍，甚至导致神经元死亡。例如，在阿尔茨海默氏症患者的大脑中，Tau 蛋白过度磷酸化会降低微管网络的稳定性，导致神经系统异常⁶。因此，检查微管网络将有助于理解神经发育和神经系统疾病的发病机制。

神经肌肉接头（NMJ）是在运动神经元轴突末梢和肌纤维之间形成的外周突触，是研究突触结构和功能的优秀而强大的模型系统⁷。Futsch 是果蝇中的一种蛋白质，与哺乳动物中发现的微管结合蛋白 MAP1B 同源⁸。它仅在神经元中表达....

研究方案

1.幼虫解剖

注意：解剖溶液血淋巴样盐水 （HL3.1）¹⁸ 和固定溶液 4% 多聚甲醛 （PFA）^19,20 在室温下使用，因为当温度过低时微管会解聚。

1. 用长钝镊子挑选一只流浪的 3^龄 幼虫。用HL3.1洗涤，并将其放在立体显微镜下的解剖皿上。
   注：徘徊的3^龄 幼虫由分枝的前螺旋体识别，并在约96小时（25°C）²¹时在管周围爬行。
2. 将幼虫的背侧或腹侧朝上放置。通过两个长气管识别背侧，通过腹部齿带识别腹侧。
   1. 根据要观察的组织，选择背侧或腹侧解剖。这将允许更精确、更详细地了解感兴趣的特定区域。对于NMJ和肌肉细胞观察，分别切开幼虫背侧和腹侧区域。
3. 别住嘴钩和尾巴。调整销钉以保持幼虫处于伸展状态。在幼虫中加入一滴HL3.1，以防止其干燥。
   注意：不含 Ca²⁺ 的 HL 3.1 可用于最大限度地减少解剖过程中肌肉的收缩。
4. 用解剖剪刀在靠近后端的地方做一个小的横向切口，但不要剪掉后端。然后沿腹侧中线向前端切开。
5. 在幼虫的四个....

讨论

这里描述了用于 果蝇 幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞的解剖和免疫染色的方案。有几个要点需要考虑。首先，在解剖过程中，避免观察到的肌肉受伤至关重要。在切除内脏之前，可能值得固定鱼角，以防止镊子和肌肉直接接触。为避免肌肉损伤或与幼虫表皮分离，重要的是要确保在洗涤和孵育过程中振荡器的速度不超过 15 rpm。此外，必须精确控制皮肤延伸，以确保清晰、完整地拍摄 NMJ 形?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342