使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞可视化微管网络

摘要

在这里，我们提出了一个详细的方案来可视化神经肌肉接头和肌肉细胞中的微管网络。结合 黑腹果蝇强大的遗传工具，该方案极大地促进了微管网络调节蛋白在神经系统中的作用的遗传筛选和微管动力学分析。

摘要

微管网络是神经系统的重要组成部分。许多微管调节蛋白的突变与神经发育障碍和神经系统疾病有关，如微管相关蛋白Tau对神经退行性疾病，微管切断蛋白Spastin和Katanin 60分别引起遗传性痉挛性截瘫和神经发育异常。检测神经元中的微管网络有利于阐明神经系统疾病的发病机制。然而，神经元的小尺寸和轴突微管束的密集排列使得微管网络的可视化具有挑战性。在这项研究中，我们描述了一种解剖幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞的方法，以及α-微管蛋白和微管相关蛋白Futsch的免疫染色，以可视化果蝇中的微管网络。神经肌肉接头使我们能够观察突触前和突触后的微管，果蝇幼虫中大尺寸的肌肉细胞可以清晰地观察微管网络。在这里，通过在黑腹果蝇中突变和过表达Katanin 60，然后检查神经肌肉接头和肌肉细胞中的微管网络，我们准确地揭示了Katanin 60在神经发育中的调节作用。因此，结合果蝇黑腹果蝇强大的遗传工具，该方案极大地促进了微管网络调节蛋白在神经系统中的作用的遗传筛选和微管动力学分析。

引言

微管（MTs）作为细胞骨架的结构成分之一，在细胞分裂、细胞生长和运动、细胞内运输和维持细胞形状等多种生物过程中发挥着重要作用。微管动力学和功能通过与其他蛋白质的相互作用进行调节，例如 MAP1、MAP2、Tau、Katanin 和驱动蛋白 1,2,3,4,5。

在神经元中，微管对于轴突和树突的发育和维持至关重要。微管异常会导致功能障碍，甚至导致神经元死亡。例如，在阿尔茨海默氏症患者的大脑中，Tau 蛋白过度磷酸化会降低微管网络的稳定性，导致神经系统异常⁶。因此，检查微管网络将有助于理解神经发育和神经系统疾病的发病机制。

神经肌肉接头（NMJ）是在运动神经元轴突末梢和肌纤维之间形成的外周突触，是研究突触结构和功能的优秀而强大的模型系统⁷。Futsch 是果蝇中的一种蛋白质，与哺乳动物中发现的微管结合蛋白 MAP1B 同源⁸。它仅在神经元中表达，并在 NMJ 突触按钮的发育中发挥作用 ^8,9。在野生型中，通过用抗Futsch进行免疫染色来观察沿NMJ过程中心运行的丝状束。当到达 NMJ 的末端时，该束能够形成由微管组成的环或失去其丝状结构，从而导致弥漫性和点状外观¹⁰。微管环与暂停的生长锥有关，这表明微管阵列是稳定的¹¹。因此，我们可以通过 Futsch 染色间接确定 NMJ 中微管的稳定发育。果蝇幼虫中大尺寸的肌肉细胞可以清晰地观察微管网络。通过分析微管的密度和形状，可以发现影响微管网络稳定性的因素。同时，可以将肌肉细胞的微管网络状态与NMJ的结果进行交叉验证，以获得更全面的结论。

许多协议已被用于研究微管的网络和动力学。然而，这些研究通常集中在体外研究12,13,14,15,16。或者，一些体内实验已经使用电子显微镜来检测细胞骨架¹⁷。根据荧光标记的抗体或化学染料与蛋白质或DNA的特异性结合，这里介绍的方法允许在体内单个神经元水平上检测NMJ中的微管网络，结果通过肌肉细胞的观察得到证实。当与果蝇黑腹果蝇中可用的强大遗传工具结合使用时，该方案是简单、稳定和可重复的，能够对体内神经系统中微管网络调节蛋白的作用进行各种表型检查和遗传筛选。

研究方案

1.幼虫解剖

注意:解剖溶液血淋巴样盐水 （HL3.1）¹⁸ 和固定溶液 4% 多聚甲醛 （PFA）^19,20 在室温下使用，因为当温度过低时微管会解聚。

1. 用长钝镊子挑选一只流浪的 3^龄 幼虫。用HL3.1洗涤，并将其放在立体显微镜下的解剖皿上。
   注:徘徊的3^龄 幼虫由分枝的前螺旋体识别，并在约96小时（25°C）²¹时在管周围爬行。
2. 将幼虫的背侧或腹侧朝上放置。通过两个长气管识别背侧，通过腹部齿带识别腹侧。
   1. 根据要观察的组织，选择背侧或腹侧解剖。这将允许更精确、更详细地了解感兴趣的特定区域。对于NMJ和肌肉细胞观察，分别切开幼虫背侧和腹侧区域。
3. 别住嘴钩和尾巴。调整销钉以保持幼虫处于伸展状态。在幼虫中加入一滴HL3.1，以防止其干燥。
   注意:不含 Ca²⁺ 的 HL 3.1 可用于最大限度地减少解剖过程中肌肉的收缩。
4. 用解剖剪刀在靠近后端的地方做一个小的横向切口，但不要剪掉后端。然后沿腹侧中线向前端切开。
5. 在幼虫的四个角上插入四个昆虫针。重新调整昆虫针，使幼虫在各个方向上最大限度地伸展。
6. 使用镊子切除内脏，同时不损伤肌肉。

2. 固定

1. 加入 100 μL PFA （4%） 将胴体浸泡 40 分钟，同时胴体仍固定在解剖皿上。
   注意: 采取有效的保护措施以避免直接接触皮肤或吸入，因为 PFA 是一种危险。
2. 卸下针脚并将样品转移到 2 mL 微量离心管中。用含有0.2%Triton X-100（0.2%PBST）的1x磷酸盐缓冲盐水冲洗PFA，以15rpm在脱色振荡器上填充2mL微量离心管10分钟。重复洗涤过程 5 次。

3. 免疫细胞化学

1. 将胴体浸入封闭剂（5%山羊血清在0.2%PBST中）中，并在室温下封闭40分钟。
2. 除去封闭剂，并用200μL的一抗（例如，抗α-微管蛋白，1:1000;抗Futsch，1:50）在4°C下用0.2%PBST稀释过夜。通过用单克隆抗α-微管蛋白免疫染色来观察肌肉微管。Anti-Futsch可以间接反映NMJ中的微管形态。
3. 一抗孵育后，用0.2%PBST洗涤幼虫10分钟，重复5次。
4. 将幼虫与200μL二抗（例如，山羊抗Mouse-488,1:1000）在室温下用0.2%PBST稀释在黑暗中孵育1.5小时。
5. 接下来，在黑暗^20,22中对微管进行染色时，将浓度为1:1000的核染料如TO-PRO（R）3碘化物（T3605）加入孵育管中30分钟。
6. 用 0.2% PBST 冲洗掉二抗和核染料 10 分钟。在黑暗中重复 5 次。

4. 安装

1. 将幼虫胴体置于载玻片上的0.2%PBST中，并在立体显微镜下进行调整。确保幼虫胴体的内表面朝上，并且所有幼虫胴体都按所需排列。
2. 用擦拭物吸收多余的PBST溶液，然后轻轻加入一滴抗淬灭封固剂。
3. 在载玻片上放置盖玻片，缓慢而轻柔地覆盖解剖的幼虫，以避免气泡。
4. 在盖玻片周围涂抹指甲油。将载玻片放在黑暗空间中以减少荧光衰减。

5. 图像采集

1. 要获取图像，请使用激光扫描共聚焦显微镜，选择60倍油浸物镜（数值孔径1.42）或类似物镜，并根据实验调整激光功率和波长。
2. 要识别 NMJ，请在 A3 段的肌肉 4 中捕获图像（如图 1F 中的位置所示）。选择 488 nm 激光以激活 α-微管蛋白或 Futsch，选择 543 nm 以激活 HRP 成像轨迹。将参数调整为 800 像素 x 800 像素的帧大小、2.0 的数码变焦和 0.8 μm 的成像间隔（图 2）。
3. 为了识别肌肉中的微管，捕获A3-A5段中肌肉2的图像（ 如图1G中的位置所示），因为它具有较少的气管分支。选择 488 nm 激光器激活 α-微管蛋白，选择 635 nm 激光器激活 T3605 成像轨道。将参数调整为1024像素x 1024像素的帧大小，3.0的数码变焦和肌肉细胞中0.4μm的成像间隔（图3）。

结果

我们演示了可视化神经肌肉接头 （NMJ） 和肌肉细胞中微管网络的分步程序。根据示意图（图1A-E）解剖后，进行免疫染色，随后在激光共聚焦显微镜或立体荧光显微镜下观察和收集图像（图1F，G）。

NMJ的突触前后微管组织都可以用抗α微管蛋白标记，通过选择激光扫描共聚焦显微镜的层厚，可以显示不同?...

讨论

这里描述了用于 果蝇 幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞的解剖和免疫染色的方案。有几个要点需要考虑。首先，在解剖过程中，避免观察到的肌肉受伤至关重要。在切除内脏之前，可能值得固定鱼角，以防止镊子和肌肉直接接触。为避免肌肉损伤或与幼虫表皮分离，重要的是要确保在洗涤和孵育过程中振荡器的速度不超过 15 rpm。此外，必须精确控制皮肤延伸，以确保清晰、完整地拍摄 NMJ 形?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342