Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Résumé

Le réseau de microtubules est une composante essentielle du système nerveux. Des mutations dans de nombreuses protéines régulatrices des microtubules sont associées à des troubles neurodéveloppementaux et à des maladies neurologiques, telles que la protéine Tau associée aux microtubules aux maladies neurodégénératives, la protéine sectionnante des microtubules Spastin et Katanin 60 provoquent respectivement une paraplégie spastique héréditaire et des anomalies neurodéveloppementales. La détection de réseaux de microtubules dans les neurones est avantageuse pour élucider la pathogenèse des troubles neurologiques. Cependant, la petite taille des neurones et la disposition dense des faisceaux de microtubules axonaux rendent difficile la visualisation des réseaux de microtubules. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de dissection de la jonction neuromusculaire larvaire et des cellules musculaires, ainsi que l’immunomarquage de la α-tubuline et de la protéine de Futsch associée aux microtubules pour visualiser les réseaux de microtubules chez Drosophila melanogaster. La jonction neuromusculaire nous permet d’observer à la fois les microtubules pré et post-synaptiques, et la grande taille des cellules musculaires de la larve de drosophile permet une visualisation claire du réseau de microtubules. Ici, en mutant et en surexprimant Katanin 60 chez Drosophila melanogaster, puis en examinant les réseaux de microtubules dans la jonction neuromusculaire et les cellules musculaires, nous révélons avec précision le rôle régulateur de Katanin 60 dans le neurodéveloppement. Par conséquent, combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Introduction

Les microtubules (MT), en tant que l’un des composants structurels du cytosquelette, jouent un rôle important dans divers processus biologiques, notamment la division cellulaire, la croissance et la motilité cellulaires, le transport intracellulaire et le maintien de la forme cellulaire. La dynamique et la fonction des microtubules sont modulées par des interactions avec d’autres protéines, telles que MAP1, MAP2, Tau, Katanine et Kinésine 1,2,3,4,5.

Dans les neurones, les microtu....

Protocole

1. Dissection des larves

REMARQUE : La solution de dissection solution saline de type hémolymphatique (HL3.1)¹⁸ et la solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde (PFA)^19,20 sont utilisées à température ambiante car les microtubules se dépolymérisent lorsque la température est trop basse.

1. Repérez une larve errante du 3^e stade à l’aide d’une longue pince émoussée. Lavez-le avec HL3.1 et placez-le sur la boîte de dissection sous le stéréomicroscope.
   NOTA : La larve errante du 3^e stade larvaire est identifiée ....

Discussion

Un protocole est décrit ici pour la dissection et l’immunomarquage des jonctions neuromusculaires et des cellules musculaires des larves de drosophile . Il y a plusieurs points essentiels à considérer. Tout d’abord, il est crucial d’éviter de blesser les muscles observés pendant le processus de dissection. Il peut être utile de fixer le filet avant de retirer les organes internes pour éviter tout contact direct entre la pince et les muscles. Pour éviter les lésions musculaires ou la séparation de.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342