Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Résumé

Le réseau de microtubules est une composante essentielle du système nerveux. Des mutations dans de nombreuses protéines régulatrices des microtubules sont associées à des troubles neurodéveloppementaux et à des maladies neurologiques, telles que la protéine Tau associée aux microtubules aux maladies neurodégénératives, la protéine sectionnante des microtubules Spastin et Katanin 60 provoquent respectivement une paraplégie spastique héréditaire et des anomalies neurodéveloppementales. La détection de réseaux de microtubules dans les neurones est avantageuse pour élucider la pathogenèse des troubles neurologiques. Cependant, la petite taille des neurones et la disposition dense des faisceaux de microtubules axonaux rendent difficile la visualisation des réseaux de microtubules. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de dissection de la jonction neuromusculaire larvaire et des cellules musculaires, ainsi que l’immunomarquage de la α-tubuline et de la protéine de Futsch associée aux microtubules pour visualiser les réseaux de microtubules chez Drosophila melanogaster. La jonction neuromusculaire nous permet d’observer à la fois les microtubules pré et post-synaptiques, et la grande taille des cellules musculaires de la larve de drosophile permet une visualisation claire du réseau de microtubules. Ici, en mutant et en surexprimant Katanin 60 chez Drosophila melanogaster, puis en examinant les réseaux de microtubules dans la jonction neuromusculaire et les cellules musculaires, nous révélons avec précision le rôle régulateur de Katanin 60 dans le neurodéveloppement. Par conséquent, combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Introduction

Les microtubules (MT), en tant que l’un des composants structurels du cytosquelette, jouent un rôle important dans divers processus biologiques, notamment la division cellulaire, la croissance et la motilité cellulaires, le transport intracellulaire et le maintien de la forme cellulaire. La dynamique et la fonction des microtubules sont modulées par des interactions avec d’autres protéines, telles que MAP1, MAP2, Tau, Katanine et Kinésine 1,2,3,4,5.

Dans les neurones, les microtubules sont essentiels au développement et au maintien des axones et des dendrites. Des anomalies dans les microtubules entraînent un dysfonctionnement et même la mort des neurones. Par exemple, dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer, l’hyperphosphorylation de la protéine Tau réduit la stabilité du réseau de microtubules, provoquant des irrégularités neurologiques⁶. Ainsi, l’examen des réseaux de microtubules contribuera à une compréhension du neurodéveloppement et de la pathogenèse des maladies neurologiques.

La jonction neuromusculaire (NMJ) est la synapse périphérique formée entre une terminaison axonale de motoneurone et une fibre musculaire, qui est un système modèle excellent et puissant pour l’étude de la structure et des fonctions synaptiques⁷. Futsch est une protéine de la drosophile qui est homologue à la protéine de liaison aux microtubules MAP1B que l’on trouve chez les mammifères⁸. Il ne s’exprime que dans les neurones et joue un rôle dans le développement des boutons synaptiques de la JNM ^8,9. Dans le type sauvage, les faisceaux filamenteux qui longent le centre des processus NMJ sont visualisés par immunomarquage avec un anti-Futsch. Lorsqu’il atteint l’extrémité de la JNM, ce faisceau a la capacité soit de former une boucle constituée de microtubules, soit de perdre sa structure filamenteuse, ce qui donne un aspect diffus et ponctué¹⁰. Les boucles de microtubules sont associées à des cônes de croissance en pause, ce qui suggère que le réseau de microtubules est stable¹¹. Par conséquent, nous pouvons déterminer indirectement le développement de microtubules stables dans la JNM par coloration de Futsch. La grande taille des cellules musculaires de la larve de drosophile permet une visualisation claire du réseau de microtubules. Les facteurs affectant la stabilité du réseau de microtubules peuvent être trouvés en analysant la densité et la forme des microtubules. Simultanément, l’état du réseau de microtubules des cellules musculaires peut être vérifié de manière croisée avec le résultat de la JNM pour obtenir des conclusions plus complètes.

De nombreux protocoles ont été utilisés pour étudier le réseau et la dynamique des microtubules. Cependant, ces recherches se sont souvent concentrées sur des études in vitro 12,13,14,15,16. Alternativement, certaines expériences in vivo ont utilisé la microscopie électronique pour détecter le cytosquelette¹⁷. Du fait de la liaison spécifique d’anticorps marqués par fluorescence ou de colorants chimiques à des protéines ou à de l’ADN, les méthodes présentées ici permettent la détection de réseaux de microtubules dans les JNM au niveau des neurones individuels in vivo, avec des résultats corroborés par des observations dans les cellules musculaires. Ce protocole est simple, stable et reproductible lorsqu’il est combiné avec les puissants outils génétiques disponibles chez Drosophila melanogaster, permettant une gamme variée d’examens phénotypiques et de criblages génétiques pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux in vivo.

Protocole

1. Dissection des larves

REMARQUE : La solution de dissection solution saline de type hémolymphatique (HL3.1)¹⁸ et la solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde (PFA)^19,20 sont utilisées à température ambiante car les microtubules se dépolymérisent lorsque la température est trop basse.

1. Repérez une larve errante du 3^e stade à l’aide d’une longue pince émoussée. Lavez-le avec HL3.1 et placez-le sur la boîte de dissection sous le stéréomicroscope.
   NOTA : La larve errante du 3^e stade larvaire est identifiée par le spiracle antérieur ramifié et rampe autour du tube à environ 96 h (25 °C)²¹.
2. Positionnez la larve avec le côté dorsal ou ventral vers le haut. Identifiez la face dorsale par les deux longues trachées et la face ventrale par les ceintures denticules abdominales.
   1. Selon le tissu à observer, optez pour une dissection dorsale ou ventrale. Cela permettra d’avoir une vue plus précise et détaillée de la zone d’intérêt spécifique. Pour l’observation de la JNM et des cellules musculaires, ouvrez les régions dorsale et ventrale des larves, respectivement.
3. Épinglez les crochets buccaux et la queue. Ajustez les broches pour maintenir la larve dans un état étendu. Ajoutez une goutte de HL3.1 à la larve pour éviter qu’elle ne se dessèche.
   REMARQUE : Le HL 3.1 sans Ca²⁺ peut être utilisé pour minimiser la contraction des muscles pendant la dissection.
4. Utilisez les ciseaux à dissection pour faire une petite coupe transversale près de l’extrémité postérieure, mais ne coupez pas l’extrémité postérieure. Coupez ensuite le long de la ligne médiane ventrale vers l’extrémité antérieure.
5. Insérez quatre épingles à insectes aux quatre coins de la larve. Réajustez les épingles à insectes de manière à ce que la larve soit étirée au maximum dans toutes les directions.
6. Utilisez la pince pour retirer les organes internes sans endommager les muscles.

2. Fixation

1. Ajouter 100 μL de PFA (4 %) pour immerger les carcasses pendant 40 min pendant qu’elles sont encore épinglées sur la boîte de dissection.
   ATTENTION : Des mesures de protection efficaces sont prises pour éviter tout contact direct avec la peau ou l’inhalation, car le PFA est un danger.
2. Démontez les broches et transférez l’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 2 ml. Rincer le PFA avec 1x solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,2 % de Triton X-100 (0,2 % PBST) pour remplir un tube de microcentrifugation de 2 mL pendant 10 min sur l’agitateur décolorant à 15 tr/min. Répétez le processus de lavage 5 fois.

3. Immunocytochimie

1. Immergez les carcasses dans un agent bloquant (5 % de sérum de chèvre dans 0,2 % de PBST) et bloquez pendant 40 min à température ambiante.
2. Retirez l’agent bloquant et remplacez-le par 200 μL de l’anticorps primaire (p. ex., anti-α-tubuline, 1 :1000 ; anti-Futsch, 1 :50) dilué avec 0,2 % de PBST à 4 °C pendant la nuit. Visualisez les microtubules musculaires par immunomarquage avec un anti-α-tubuline monoclonal. L’anti-Futsch peut refléter indirectement la morphologie des microtubules dans la JNM.
3. Après l’incubation de l’anticorps primaire, laver les larves avec du PBST à 0,2 % pendant 10 min. Répéter 5 fois.
4. Incuber les larves avec 200 μL d’anticorps secondaires (p. ex., anticorps de chèvre anti-Mouse-488, 1 :1000) dilués avec 0,2 % de PBST à température ambiante pendant 1,5 h dans l’obscurité.
5. Ensuite, ajoutez un colorant nucléaire tel que l’iodure TO-PRO(R) 3 (T3605) à une concentration de 1 :1000 dans le tube d’incubation pendant 30 min lors de la coloration des microtubules dans l’obscurité^20,22.
6. Rincez l’anticorps secondaire et le colorant nucléaire avec 0,2 % de PBST pendant 10 minutes. Répétez 5 fois dans l’obscurité.

4. Montage

1. Placer la carcasse de la larve dans du PBST à 0,2 % sur une lame de verre et l’ajuster au stéréomicroscope. Assurez-vous que la surface intérieure de la carcasse larvaire est orientée vers le haut et que toutes les carcasses larvaires sont disposées comme vous le souhaitez.
2. Absorbez l’excès de solution PBST à l’aide d’une lingette et ajoutez délicatement une goutte de produit de montage anti-décoloration.
3. Placez une lamelle sur la lame pour couvrir les larves disséquées lentement et doucement afin d’éviter les bulles.
4. Appliquez du vernis à ongles autour de la lamelle. Placez la diapositive dans l’espace sombre pour réduire l’atténuation des fluorescents.

5. Acquisition d’images

1. Pour acquérir les images, utilisez un microscope confocal à balayage laser, sélectionnez l’objectif à immersion dans l’huile 60x (ouverture numérique 1,42) ou similaire, et ajustez la puissance et la longueur d’onde du laser en fonction de l’expérience.
2. Pour identifier la JNM, capturez des images dans le muscle 4 du segment A3 (comme indiqué dans l’emplacement de la figure 1F). Sélectionnez un laser de 488 nm pour activer la α-tubuline ou le Futsch et un laser de 543 nm pour activer la piste d’imagerie HRP. Ajustez les paramètres à une taille d’image de 800 pixels x 800 pixels, à un zoom numérique de 2,0 et à un intervalle d’imagerie de 0,8 μm dans les JNM (Figure 2).
3. Pour identifier les microtubules dans le muscle, capturez des images du muscle 2 dans le segment A3-A5 (comme indiqué à l’emplacement de la figure 1G) car il a moins de branches trachéales. Choisissez un laser de 488 nm pour activer la α-tubuline et un laser de 635 nm pour activer la piste d’imagerie T3605. Ajustez les paramètres à une taille d’image de 1024 pixels x 1024 pixels, à un zoom numérique de 3,0 et à un intervalle d’imagerie de 0,4 μm dans les cellules musculaires (Figure 3).

Résultats

Nous avons démontré une procédure étape par étape pour visualiser le réseau de microtubules dans les jonctions neuromusculaires (JNM) et les cellules musculaires. Après la dissection selon le schéma de principe (Figure 1A-E), l’immunomarquage est effectué, puis les images sont observées et recueillies sous un microscope confocal laser ou un microscope à fluorescence stéréoscopique (Figure 1F,G).

Discussion

Un protocole est décrit ici pour la dissection et l’immunomarquage des jonctions neuromusculaires et des cellules musculaires des larves de drosophile . Il y a plusieurs points essentiels à considérer. Tout d’abord, il est crucial d’éviter de blesser les muscles observés pendant le processus de dissection. Il peut être utile de fixer le filet avant de retirer les organes internes pour éviter tout contact direct entre la pince et les muscles. Pour éviter les lésions musculaires ou la séparation de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342