Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, nöromüsküler kavşaklar ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.

Özet

Mikrotübül ağı, sinir sisteminin önemli bir bileşenidir. Birçok mikrotübül düzenleyici proteindeki mutasyonlar nörogelişimsel bozukluklar ve nörolojik hastalıklarla ilişkilidir, örneğin mikrotübül ile ilişkili protein Tau nörodejeneratif hastalıklara, mikrotübül ayırıcı protein Spastin ve Katanin 60 sırasıyla kalıtsal spastik paraplejiye ve nörogelişimsel anormalliklere neden olur. Nöronlardaki mikrotübül ağlarının saptanması, nörolojik bozuklukların patogenezinin aydınlatılmasında avantajlıdır. Bununla birlikte, nöronların küçük boyutu ve aksonal mikrotübül demetlerinin yoğun düzenlenmesi, mikrotübül ağlarını görselleştirmeyi zorlaştırır. Bu çalışmada, larva nöromüsküler kavşağı ve kas hücrelerinin diseksiyonunun yanı sıra Drosophila melanogaster'deki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için α-tübülin ve mikrotübül ile ilişkili protein Futsch'un immün boyaması için bir yöntem tanımlanmıştır. Nöromüsküler kavşak, hem sinaptik öncesi hem de sonrası mikrotübülleri gözlemlememize izin verir ve Drosophila larvasındaki büyük kas hücreleri, mikrotübül ağının net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Burada, Drosophila melanogaster'de Katanin 60'ı mutasyona uğratarak ve aşırı eksprese ederek ve daha sonra nöromüsküler kavşak ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını inceleyerek, Katanin 60'ın nörogelişimdeki düzenleyici rolünü doğru bir şekilde ortaya koyuyoruz. Bu nedenle, Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.

Giriş

Hücre iskeletinin yapısal bileşenlerinden biri olan mikrotübüller (MT'ler), hücre bölünmesi, hücre büyümesi ve hareketliliği, hücre içi taşıma ve hücre şeklinin korunması dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Mikrotübül dinamikleri ve işlevi, MAP1, MAP2, Tau, Katanin ve Kinesin 1,2,3,4,5 gibi diğer proteinlerle etkileşimlerle modüle edilir.

Nöronlarda, mikrotübüller aksonların ve dendritlerin gelişimi ve bakımı için gereklidir. Mikrotübüllerdeki anormallikler işlev bozukluğuna ve hatta nöronların ölümüne yol açar. Örneğin, Alzheimer hastalarının beyninde, Tau protein hiperfosforilasyonu, mikrotübül ağının stabilitesini azaltarak nörolojik düzensizliklere neden olur6. Bu nedenle, mikrotübül ağlarının incelenmesi, nörogelişimin ve nörolojik hastalıkların patogenezinin anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.

Nöromüsküler kavşak (NMJ), sinaptik yapı ve işlevleri incelemek için mükemmel ve güçlü bir model sistem olan bir motor nöron akson terminali ile bir kas lifi arasında oluşan periferik sinapstır7. Futsch, Drosophila'da memelilerde bulunan mikrotübül bağlayıcı protein MAP1B'ye homolog olan bir proteindir8. Sadece nöronlarda eksprese edilir ve NMJ'nin sinaptik düğmeleriningelişiminde rol oynar 8,9. Yabani tipte, NMJ işlemlerinin merkezi boyunca uzanan filamentli demetler, anti-Futsch ile immün boyama ile görselleştirilir. NMJ'nin sonuna ulaştığında, bu demet ya mikrotübüllerden oluşan bir halka oluşturma ya da ipliksi yapısını kaybetme yeteneğine sahiptir, bu da dağınık ve noktasal bir görünümeneden olur 10. Mikrotübül döngüleri, duraklatılmış büyüme konileri ile ilişkilidir, bu da mikrotübül dizisinin kararlıolduğunu gösterir 11. Bu nedenle, NMJ'deki kararlı mikrotübül gelişimini Futsch boyama ile dolaylı olarak belirleyebiliriz. Drosophila larvasındaki büyük kas hücreleri, mikrotübül ağının net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Mikrotübül ağının stabilitesini etkileyen faktörler, mikrotübüllerin yoğunluğu ve şekli analiz edilerek bulunabilir. Aynı zamanda, kas hücrelerinin mikrotübül ağ durumu, daha kapsamlı sonuçlar elde etmek için NMJ sonucu ile çapraz doğrulanabilir.

Mikrotübüllerin ağını ve dinamiklerini araştırmak için birçok protokol kullanılmıştır. Ancak bu araştırmalar sıklıkla in vitro çalışmalaraodaklanmıştır 12,13,14,15,16. Alternatif olarak, bazı in vivo deneylerde hücre iskeletini tespit etmek için elektron mikroskobukullanılmıştır 17. Floresan etiketli antikorların veya kimyasal boyaların proteinlere veya DNA'ya spesifik bağlanmasına göre, burada sunulan yöntemler, NMJ'deki mikrotübül ağlarının in vivo olarak bireysel nöronlar düzeyinde saptanmasına izin verir ve sonuçlar kas hücrelerindeki gözlemlerle doğrulanır. Bu protokol, Drosophila melanogaster'de bulunan güçlü genetik araçlarla birleştirildiğinde basit, kararlı ve tekrarlanabilir olup, mikrotübül ağ düzenleyici proteinlerin sinir sistemindeki rolü için çok çeşitli fenotipik incelemelere ve genetik taramalara olanak tanır.

Protokol

1. Larvaların diseksiyonu

NOT: Diseksiyon solüsyonu hemolenf benzeri salin (HL3.1)18 ve sabitleme solüsyonu %4 paraformaldehit (PFA)19,20 oda sıcaklığında kullanılır, çünkü sıcaklık çok düşük olduğunda mikrotübüller depolimerize olur.

  1. Uzun künt forsepsli dolaşan bir 3. instar larvası seçin. HL3.1 ile yıkayın ve stereomikroskop altında diseksiyon kabına yerleştirin.
    NOT: Gezici 3. instar larva, dallanmış anterior spiracle ile tanımlanır ve yaklaşık 96 saat (25 °C) 21'de tüpün etrafında sürünür.
  2. Larvaları dorsal veya ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Dorsal tarafı iki uzun trakea ile ve ventrali abdominal diş eti kayışları ile tanımlayın.
    1. Gözlemlenecek dokuya bağlı olarak, dorsal veya ventral diseksiyonu tercih edin. Bu, belirli bir ilgi alanının daha kesin ve ayrıntılı bir görünümünü sağlayacaktır. NMJ ve kas hücresi gözlemi için sırasıyla larva dorsal ve ventral bölgeleri kesin.
  3. Ağız kancalarını ve kuyruğu sabitleyin. Larvaları uzatılmış durumda tutmak için pimleri ayarlayın. Kurumasını önlemek için larvaya bir damla HL3.1 ekleyin.
    NOT: Diseksiyon sırasında kasların kasılmasını en aza indirmek için Ca2+ içermeyen HL 3.1 kullanılabilir.
  4. Arka uca yakın küçük bir enine kesim yapmak için diseksiyon makasını kullanın, ancak arka ucu kesmeyin. Sonra ventral orta hat boyunca ön uca doğru kesin.
  5. Larvaların dört köşesine dört böcek iğnesi yerleştirin. Böcek pimlerini, larva her yöne maksimum gerilecek şekilde yeniden ayarlayın.
  6. Kaslara zarar vermeden iç organları çıkarmak için forseps kullanın.

2. Fiksasyon

  1. Karkaslar hala diseksiyon kabına tutturulmuşken karkasları 40 dakika daldırmak için 100 μL PFA (%4) ekleyin.
    DİKKAT: PFA bir tehlike olduğundan, cilt ile doğrudan teması veya solumayı önlemek için etkili koruma önlemleri alınır.
  2. Pimleri sökün ve numuneyi 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. PFA'yı %0,2 Triton X-100 (%0,2 PBST) içeren 1x fosfat tamponlu salin ile durulayın ve 2 mL mikrosantrifüj tüpünü 15 rpm'de renk açıcı çalkalayıcıda 10 dakika doldurun. Yıkama işlemini 5 kez tekrarlayın.

3. İmmünositokimya

  1. Karkasları bloke edici maddeye (%0.2 PBST'de %5 keçi serumu) daldırın ve oda sıcaklığında 40 dakika bloke edin.
  2. Bloke edici ajanı çıkarın ve 200 μL primer antikor ile değiştirin (ör., anti-α-tubulin, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) gece boyunca 4 ° C'de% 0.2 PBST ile seyreltilir. Monoklonal anti-α-tubulin ile immün boyama yaparak kas mikrotübüllerini görselleştirin. Anti-Futsch, NMJ'deki mikrotübül morfolojisini dolaylı olarak yansıtabilir.
  3. Primer antikorun inkübasyonundan sonra, larvaları 10 dakika boyunca% 0.2 PBST ile yıkayın.
  4. Larvaları 200 μL ikincil antikor ile inkübe edin (ör., keçi anti-Mouse-488, 1:1000) karanlıkta 1.5 saat oda sıcaklığında% 0.2 PBST ile seyreltilmiş.
  5. Daha sonra, mikrotübülleri karanlıkta boyarken 3605:1000 konsantrasyonda inkübasyon tüpüne 1:1000 konsantrasyonda TO-PRO(R)20,22 iyodür (T30) gibi bir nükleer boya ekleyin.
  6. İkincil antikoru ve nükleer boyayı% 0.2 PBST ile 10 dakika durulayın. Karanlıkta 5x tekrarlayın.

4. Montaj

  1. Larva karkasını bir cam slayt üzerine% 0.2 PBST'ye yerleştirin ve stereomikroskop altında ayarlayın. Larva karkasının iç yüzeyinin yukarı baktığından ve tüm larva karkaslarının istenildiği gibi düzenlendiğinden emin olun.
  2. Fazla PBST çözeltisini bir mendille emdirin ve nazikçe bir damla antifade montaj ortamı ekleyin.
  3. Kabarcıkları önlemek için disseke edilen larvaları yavaşça ve nazikçe örtmek için slaydın üzerine bir lamel yerleştirin.
  4. Lamelin etrafına oje sürün. Floresan zayıflamasını azaltmak için slaytı karanlık alana yerleştirin.

5. Görüntü edinme

  1. Görüntüleri elde etmek için bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın, 60x yağa daldırma objektifini (sayısal açıklık 1.42) veya benzerini seçin ve deneye göre lazer gücünü ve dalga boyunu ayarlayın.
  2. NMJ'yi tanımlamak için, A3 segmentindeki kas 4'teki görüntüleri yakalayın ( Şekil 1F'deki konumda gösterildiği gibi). α-tubulin veya Futsch'u etkinleştirmek için 488 nm'lik bir lazer ve HRP görüntüleme izini etkinleştirmek için 543 nm'lik bir lazer seçin. Parametreleri 800 piksel x 800 piksel çerçeve boyutuna, 2,0 dijital yakınlaştırmaya ve NMJ'lerde 0,8 μm görüntüleme aralığına ayarlayın (Şekil 2).
  3. Kastaki mikrotübülleri tanımlamak için, daha az trakeal dala sahip olduğu için A3-A5 segmentindeki ( Şekil 1G'deki konumda gösterildiği gibi) kas 2'nin görüntülerini yakalayın. α-tubulini etkinleştirmek için 488 nm lazer ve T3605 görüntüleme izini etkinleştirmek için 635 nm lazer seçin. Parametreleri 1024 piksel x 1024 piksel çerçeve boyutuna, 3,0 dijital yakınlaştırmaya ve kas hücrelerinde 0,4 μm görüntüleme aralığına ayarlayın (Şekil 3).

Sonuçlar

Hem nöromüsküler kavşaklarda (NMJ'ler) hem de kas hücrelerinde mikrotübül ağını görselleştirmek için adım adım bir prosedür gösterdik. Şematik diyagrama (Şekil 1A-E) göre diseksiyonu takiben, immün boyama yapılır ve görüntüler daha sonra bir lazer konfokal mikroskop veya stereoskopik floresan mikroskobu altında izlenir ve toplanır (Şekil 1F,G).

NMJ'nin hem sinaptik öncesi...

Tartışmalar

Burada Drosophila larva nöromüsküler kavşaklarının ve kas hücrelerinin diseksiyonu ve immün boyanması için bir protokol tanımlanmıştır. Dikkate alınması gereken birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, diseksiyon işlemi sırasında gözlemlenen kasların yaralanmasını önlemek çok önemlidir. Forseps ve kaslar arasında doğrudan teması önlemek için iç organları çıkarmadan önce filetoyu sabitlemeye değer olabilir. Kas hasarını veya larva epidermisinden ayrılmayı önlemek için...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Dr. Ying Xiong'a el yazması hakkındaki tartışmalar ve yorumlar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSFC) C. M.'ye (31500839) verilen bir hibe ile desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidininvitrogenA30104dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting MediumBeyotimeP0128M
FV10-ASW confocal microscopeOlympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugatedThermo FisherA-11001dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710Zeiss
Micro Scissors66vision54138B
Mouse anti-Futsch antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank  22C10dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibodySigmaT5168dilute 1:1,000
ParaformaldehydeWako168-20955Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien PinsEntomoravia0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRPJackson ImmunoResearchdilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodideInvitrogenT3605dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8Kylin-Bell lab instrumentsE0018
TritonX-100BioFroxx1139
Tweezers dumont500342

Referanslar

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Drosophila Larva N rom sk ler Kav akKas H creleriMikrot b l AN rogeli imsel BozukluklarN rolojik Hastal klarMikrot b l li kili Protein TauMikrot b l Ay r c Protein SpastinKatanin 60Kal tsal Spastik Paraplejimm n BoyamaDrosophila MelanogasterPre sinaptik Mikrot b llerPost sinaptik Mikrot b llerMutasyonA r EkspresyonD zenleyici Rol

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır