Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Abstract

La rete di microtubuli è una componente essenziale del sistema nervoso. Le mutazioni in molte proteine regolatorie dei microtubuli sono associate a disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurologiche, come la proteina Tau associata ai microtubuli per le malattie neurodegenerative, la proteina di recisione dei microtubuli Spastin e Katanin 60 causano rispettivamente paraplegia spastica ereditaria e anomalie dello sviluppo neurologico. Il rilevamento di reti di microtubuli nei neuroni è vantaggioso per chiarire la patogenesi dei disturbi neurologici. Tuttavia, le piccole dimensioni dei neuroni e la disposizione densa dei fasci di microtubuli assonali rendono difficile la visualizzazione delle reti di microtubuli. In questo studio, descriviamo un metodo per la dissezione della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari, nonché l'immunocolorazione della α-tubulina e della proteina Futsch associata ai microtubuli per visualizzare le reti di microtubuli in Drosophila melanogaster. La giunzione neuromuscolare ci permette di osservare sia i microtubuli pre che post-sinaptici, e le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. Qui, mutando e sovraesprimendo la Katanina 60 in Drosophila melanogaster, e quindi esaminando le reti di microtubuli nella giunzione neuromuscolare e nelle cellule muscolari, riveliamo accuratamente il ruolo regolatore della Katanina 60 nel neurosviluppo. Pertanto, combinato con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Introduzione

I microtubuli (MT), come uno dei componenti strutturali del citoscheletro, svolgono un ruolo importante in diversi processi biologici, tra cui la divisione cellulare, la crescita e la motilità cellulare, il trasporto intracellulare e il mantenimento della forma cellulare. La dinamica e la funzione dei microtubuli sono modulate dalle interazioni con altre proteine, come MAP1, MAP2, Tau, Katanina e Kinesina 1,2,3,4,5.

Nei neuroni, i microtubuli sono essenziali per lo sviluppo e il mantenimento di assoni e dendriti. Le anomalie nei microtubuli portano a disfunzioni e persino alla morte dei neuroni. Ad esempio, nel cervello dei malati di Alzheimer, l'iperfosforilazione della proteina Tau riduce la stabilità della rete di microtubuli, causando irregolarità neurologiche⁶. Pertanto, l'esame delle reti di microtubuli contribuirà alla comprensione del neurosviluppo e della patogenesi delle malattie neurologiche.

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi periferica formata tra un terminale dell'assone del motoneurone e una fibra muscolare, che è un eccellente e potente sistema modello per lo studio della struttura e delle funzioni sinaptiche⁷. Futsch è una proteina della Drosophila omologa alla proteina legante i microtubuli MAP1B presente nei mammiferi⁸. È espresso solo nei neuroni e svolge un ruolo nello sviluppo dei pulsanti sinaptici del NMJ ^8,9. Nel wild-type, i fasci filamentosi che corrono lungo il centro dei processi NMJ sono visualizzati mediante immunocolorazione con anti-Futsch. Quando raggiunge l'estremità di NMJ, questo fascio ha la capacità di formare un anello costituito da microtubuli o di perdere la sua struttura filamentosa, risultando in un aspetto diffuso e punteggiato¹⁰. Le anse dei microtubuli sono associate a coni di crescita in pausa, il che suggerisce che l'array di microtubuli è stabile¹¹. Pertanto, possiamo determinare indirettamente lo sviluppo stabile dei microtubuli nella NMJ mediante colorazione Futsch. Le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. I fattori che influenzano la stabilità della rete di microtubuli possono essere trovati analizzando la densità e la forma dei microtubuli. Allo stesso tempo, lo stato della rete di microtubuli delle cellule muscolari può essere verificato in modo incrociato con il risultato della NMJ per ottenere conclusioni più complete.

Molti protocolli sono stati impiegati per studiare la rete e la dinamica dei microtubuli. Tuttavia, queste ricerche si sono spesso concentrate su studi in vitro 12,13,14,15,16. In alternativa, alcuni esperimenti in vivo hanno impiegato la microscopia elettronica per rilevare il citoscheletro¹⁷. In base al legame specifico di anticorpi marcati con fluorescenza o coloranti chimici a proteine o DNA, i metodi qui presentati consentono di rilevare reti di microtubuli nella NMJ a livello di singoli neuroni in vivo, con risultati corroborati da osservazioni in cellule muscolari. Questo protocollo è semplice, stabile e ripetibile se combinato con i potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila melanogaster, consentendo una vasta gamma di esami fenotipici e screening genetici per il ruolo delle proteine regolatorie della rete di microtubuli nel sistema nervoso in vivo.

Protocollo

1. Dissezione delle larve

NOTA: La soluzione salina emolinfa-simile (HL3.1)¹⁸ e la soluzione fissante paraformaldeide al 4% (PFA)^19,20 vengono utilizzate a temperatura ambiente perché i microtubuli depolimerizzano quando la temperatura è troppo bassa.

1. Scegli una larva vagante di 3^° stadio con una lunga pinza smussata. Lavarlo con HL3.1 e posizionarlo sul piatto di dissezione sotto lo stereomicroscopio.
   NOTA: La larva errante di 3^° stadio è identificata dallo spiracolo anteriore ramificato e striscia intorno al tubo a circa 96 h (25 °C)²¹.
2. Posizionare la larva con il lato dorsale o ventrale rivolto verso l'alto. Identificare il lato dorsale dalle due lunghe trachee e il ventrale dalle cinture dentellari addominali.
   1. A seconda del tessuto da osservare, optare per la dissezione dorsale o ventrale. Ciò consentirà una visione più precisa e dettagliata della specifica area di interesse. Per l'osservazione della NMJ e delle cellule muscolari, tagliare rispettivamente le regioni larvali, dorsale e ventrale.
3. Appunta gli uncini per la bocca e la coda. Regolare i perni per mantenere la larva in uno stato esteso. Aggiungere una goccia di HL3.1 alla larva per evitare che si secchi.
   NOTA: L'HL 3.1 senza Ca²⁺ può essere utilizzato per ridurre al minimo la contrazione dei muscoli durante la dissezione.
4. Usa le forbici da dissezione per fare un piccolo taglio trasversale vicino all'estremità posteriore, ma non tagliare l'estremità posteriore. Quindi tagliare lungo la linea mediana ventrale verso l'estremità anteriore.
5. Inserire quattro spille per insetti sui quattro angoli della larva. Regolare nuovamente gli spilli degli insetti in modo che la larva sia allungata al massimo in tutte le direzioni.
6. Usa le pinze per rimuovere gli organi interni senza danneggiare i muscoli.

2. Fissazione

1. Aggiungere 100 μL di PFA (4%) per immergere le carcasse per 40 minuti mentre le carcasse sono ancora appuntate sul piatto di dissezione.
   ATTENZIONE: Vengono adottate misure di protezione efficaci per evitare il contatto diretto con la pelle o l'inalazione, poiché il PFA è un pericolo.
2. Smontare i perni e trasferire il campione in una provetta per microcentrifuga da 2 mL. Risciacquare il PFA con 1 soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,2% di Triton X-100 (0,2% PBST) per riempire una provetta da microcentrifuga da 2 ml per 10 minuti sullo shaker di decolorazione a 15 giri/min. Ripetere il processo di lavaggio 5 volte.

3. Immunocitochimica

1. Immergere le carcasse in un agente bloccante (5% di siero di capra in 0,2% PBST) e bloccare per 40 minuti a temperatura ambiente.
2. Rimuovere l'agente bloccante e sostituirlo con 200 μL dell'anticorpo primario (ad es. anti-α-tubulina, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) diluito con PBST allo 0,2% a 4 °C per una notte. Visualizza i microtubuli muscolari mediante immunocolorazione con anti-tubulina monoclonale α. L'anti-Futsch può riflettere indirettamente la morfologia dei microtubuli nella NMJ.
3. Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, lavare le larve con PBST allo 0,2% per 10 min.
4. Incubare le larve con 200 μL di anticorpo secondario (ad es. capra anti-Mouse-488, 1:1000) diluito con PBST allo 0,2% a temperatura ambiente per 1,5 ore al buio.
5. Successivamente, aggiungere un colorante nucleare come lo ioduro TO-PRO(R) 3 (T3605) a una concentrazione di 1:1000 nel tubo di incubazione per 30 minuti durante la colorazione dei microtubuli al buio^20,22.
6. Risciacquare l'anticorpo secondario e il colorante nucleare con PBST allo 0,2% per 10 minuti. Ripeti 5 volte al buio.

4. Montaggio

1. Posizionare la carcassa larvale allo 0,2% di PBST su un vetrino e regolarla al microscopio stereoscopico. Assicurarsi che la superficie interna della carcassa larvale sia rivolta verso l'alto e che tutte le carcasse larvali siano disposte come desiderato.
2. Assorbire la soluzione PBST in eccesso con una salvietta e aggiungere delicatamente una goccia di mezzo di montaggio antisbiadimento.
3. Posizionare un vetrino coprioggetti sul vetrino per coprire le larve sezionate lentamente e delicatamente per evitare la formazione di bolle.
4. Applicare lo smalto per unghie intorno al vetrino coprioggetti. Posizionare il vetrino nello spazio buio per ridurre l'attenuazione della fluorescenza.

5. Acquisizione delle immagini

1. Per acquisire le immagini, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser, selezionare l'obiettivo a immersione in olio 60x (apertura numerica 1,42) o simile e regolare la potenza e la lunghezza d'onda del laser in base all'esperimento.
2. Per identificare l'NMJ, acquisire immagini nel muscolo 4 nel segmento A3 (come mostrato nella posizione nella Figura 1F). Selezionare un laser a 488 nm per attivare la α-tubulina o Futsch e 543 nm per attivare la traccia di imaging HRP. Regolare i parametri su una dimensione del fotogramma di 800 pixel x 800 pixel, uno zoom digitale di 2,0 e un intervallo di imaging di 0,8 μm in NMJ (Figura 2).
3. Per identificare i microtubuli nel muscolo, acquisire immagini del muscolo 2 nel segmento A3-A5 (come mostrato nella posizione nella Figura 1G) poiché ha meno rami tracheali. Scegli un laser da 488 nm per attivare la α-tubulina e un laser da 635 nm per attivare la traccia di imaging T3605. Regolare i parametri su una dimensione del fotogramma di 1024 pixel x 1024 pixel, uno zoom digitale di 3,0 e un intervallo di imaging di 0,4 μm nelle cellule muscolari (Figura 3).

Risultati

Abbiamo dimostrato una procedura passo-passo per visualizzare la rete di microtubuli sia nelle giunzioni neuromuscolari (NMJ) che nelle cellule muscolari. Dopo la dissezione secondo il diagramma schematico (Figura 1A-E), viene eseguita l'immunocolorazione e le immagini vengono successivamente osservate e raccolte con un microscopio confocale laser o un microscopio stereoscopico a fluorescenza (Figura 1F,G).

Discussione

Qui viene descritto un protocollo per la dissezione e l'immunocolorazione delle giunzioni neuromuscolari larvali e delle cellule muscolari della Drosophila . Ci sono diversi punti essenziali da considerare. In primo luogo, evitare lesioni ai muscoli osservati è fondamentale durante il processo di dissezione. Potrebbe valere la pena fissare il filetto prima di rimuovere gli organi interni per evitare il contatto diretto tra le pinze e i muscoli. Per evitare danni muscolari o la separazione dall'epidermide larval...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342