Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Resumo

A rede de microtúbulos é um componente essencial do sistema nervoso. Mutações em muitas proteínas reguladoras dos microtúbulos estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento e doenças neurológicas, tais como proteína Tau associada a microtúbulos a doenças neurodegenerativas, proteína cortadora de microtúbulos Spastin e Katanin 60 causam paraplegia espástica hereditária e anormalidades do neurodesenvolvimento, respectivamente. A detecção de redes de microtúbulos em neurônios é vantajosa para elucidar a patogênese de distúrbios neurológicos. No entanto, o pequeno tamanho dos neurônios e o arranjo denso dos feixes axonais de microtúbulos tornam a visualização das redes de microtúbulos um desafio. Neste estudo, descrevemos um método para dissecção da junção neuromuscular larval e células musculares, bem como imunomarcação de α-tubulina e proteína associada a microtúbulos Futsch para visualização de redes de microtúbulos em Drosophila melanogaster. A junção neuromuscular permite observar microtúbulos pré e pós-sinápticos, e o grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma clara visualização da rede de microtúbulos. Aqui, ao mutar e superexpressar Katanin 60 em Drosophila melanogaster, e então examinar as redes de microtúbulos na junção neuromuscular e células musculares, revelamos com precisão o papel regulatório de Katanin 60 no neurodesenvolvimento. Portanto, combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Introdução

Os microtúbulos (MTs), como um dos componentes estruturais do citoesqueleto, desempenham um papel importante em diversos processos biológicos, incluindo divisão celular, crescimento e motilidade celular, transporte intracelular e manutenção da forma celular. A dinâmica e a função dos microtúbulos são moduladas por interações com outras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin e Kinesin 1,2,3,4,5.

Nos neurônios, os microtúbulos são essenciais para o desenvolvimento e manutenção de axônios e dendritos. Anormalidades nos microtúbulos levam à disfunção e até mesmo à morte dos neurônios. Por exemplo, no cérebro de pacientes com Alzheimer, a hiperfosforilação da proteína Tau reduz a estabilidade da rede de microtúbulos, causando irregularidades neurológicas⁶. Assim, o exame das redes de microtúbulos contribuirá para a compreensão do neurodesenvolvimento e da patogênese das doenças neurológicas.

A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse periférica formada entre um axônio terminal do neurônio motor e uma fibra muscular, que é um excelente e poderoso sistema modelo para o estudo da estrutura e funções^sinápticas7. Futsch é uma proteína de Drosophila homóloga à proteína de ligação a microtúbulos MAP1B encontrada em mamíferos⁸. É expressa apenas em neurônios e desempenha um papel no desenvolvimento dos botões sinápticos do NMJ ^8,9. No tipo selvagem, feixes filamentosos que correm ao longo do centro dos processos NMJ são visualizados por imunomarcação com anti-Futsch. Ao atingir o final do NMJ, esse feixe tem a capacidade de formar uma alça constituída por microtúbulos ou de perder sua estrutura filamentosa, resultando em uma aparência difusa e puntiforme¹⁰. Alças de microtúbulos estão associadas a cones de crescimento pausados, o que sugere que a matriz de microtúbulos é estável¹¹. Portanto, podemos determinar indiretamente o desenvolvimento de microtúbulos estáveis no NMJ pela coloração de Futsch. O grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma visualização clara da rede de microtúbulos. Os fatores que afetam a estabilidade da rede de microtúbulos podem ser encontrados através da análise da densidade e forma dos microtúbulos. Simultaneamente, o estado da rede de microtúbulos das células musculares pode ser verificado de forma cruzada com o resultado do NMJ para obter conclusões mais abrangentes.

Muitos protocolos têm sido empregados para investigar a rede e a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, essas pesquisas têm frequentemente se concentrado em estudos in vitro 12,13,14,15,16. Alternativamente, alguns experimentos in vivo têm empregado microscopia eletrônica para detectar o citoesqueleto¹⁷. De acordo com a ligação específica de anticorpos fluorescentemente marcados ou corantes químicos a proteínas ou DNA, os métodos aqui apresentados permitem a detecção de redes de microtúbulos em NMJ em nível de neurônios individuais in vivo, com resultados corroborados por observações em células musculares. Este protocolo é simples, estável e repetível quando combinado com as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila melanogaster, permitindo uma gama diversificada de exames fenotípicos e rastreios genéticos para o papel de proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso in vivo.

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Protocolo

1. Dissecção de larvas

OBS: A solução dissecante salina hemolinf-símile (HL3.1)¹⁸ e a solução fixadora paraformaldeído (PFA) a 4%^19,20 são utilizadas à temperatura ambiente^, pois os microtúbulos se despolimerizam quando a temperatura é muito baixa.

1. Escolha uma larva errante de^3º ínstar com pinças longas e rombas. Lave-o com HL3.1 e coloque-o na placa de dissecção sob o estereomicroscópio.
   NOTA: Larva errante de^3º ínstar é identificada por espiráculo anterior ramificado e rasteja ao redor do tubo a aproximadamente 96 h (25 °C)²¹.
2. Posicione a larva com o lado dorsal ou ventral para cima. Identificar o lado dorsal pelas duas traqueias longas e o ventral pelas cintas denticulares abdominais.
   1. Dependendo do tecido a ser observado, opte pela dissecção dorsal ou ventral. Isso permitirá uma visão mais precisa e detalhada da área específica de interesse. Para observação do NMJ e das células musculares, abrir as regiões dorsal e ventral da larva, respectivamente.
3. Fixe os ganchos da boca e a cauda. Ajuste os pinos para manter a larva em um estado prolongado. Adicione uma gota de HL3.1 à larva para evitar que seque.
   NOTA: Ca²⁺ - HL livre 3.1 pode ser usado para minimizar a contração dos músculos durante a dissecção.
4. Use a tesoura dissecante para fazer um pequeno corte transversal próximo à extremidade posterior, mas não corte a extremidade posterior. Em seguida, corte ao longo da linha média ventral em direção à extremidade anterior.
5. Insira quatro pinos de insetos nos quatro cantos da larva. Reajuste os pinos do inseto de forma que a larva seja esticada ao máximo em todas as direções.
6. Use a pinça para remover órgãos internos, sem danificar os músculos.

2. Fixação

1. Adicionar 100 μL de PFA (4%) para imergir as carcaças por 40 min enquanto as carcaças ainda estão fixadas na placa dissecante.
   CUIDADO: Medidas de proteção eficazes são tomadas para evitar o contato direto com a pele ou inalação, pois o PFA é um perigo.
2. Desmonte os pinos e transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Enxaguar o PFA com 1x solução salina tamponada com fosfato contendo Triton X-100 a 0,2% (0,2% PBST) para encher 2 mL de tubo de microcentrífuga por 10 min no agitador descolorante a 15 rpm. Repita o processo de lavagem 5x.

3. Imunocitoquímica

1. Imergir as carcaças em bloqueador (5% de soro caprino em 0,2% de PBST) e bloquear por 40 min à temperatura ambiente.
2. Remova o agente bloqueador e substitua-o por 200 μL do anticorpo primário (por exemplo, anti-α-tubulina, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) diluído com PBST a 0,2% a 4 °C durante a noite. Visualize os microtúbulos musculares por imunomarcação com anti-α-tubulina monoclonal. Anti-Futsch pode refletir indiretamente a morfologia dos microtúbulos na JNM.
3. Após a incubação do anticorpo primário, lavar as larvas com PBST a 0,2% por 10 min.
4. Incubar as larvas com 200 μL de anticorpo secundário (por exemplo, cabra anti-Mouse-488, 1:1000) diluído com 0,2% PBST à temperatura ambiente por 1,5 h no escuro.
5. Em seguida, adicionar um corante nuclear como o iodeto TO-PRO(R) 3 (T3605) na concentração de 1:1000 no tubo de incubação por 30 min ao corar os microtúbulos no escuro^20,22.
6. Enxaguar o anticorpo secundário e o corante nuclear com PBST a 0,2% por 10 min. Repita 5x no escuro.

4. Montagem

1. Colocar a carcaça da larva em PBST 0,2% sobre uma lâmina de vidro e ajustá-la sob o estereomicroscópio. Certifique-se de que a superfície interna da carcaça da larva esteja voltada para cima e que todas as carcaças das larvas estejam dispostas conforme desejado.
2. Absorva o excesso de solução PBST com um lenço umedecido e adicione suavemente uma gota de meio de montagem antifade.
3. Coloque uma lamínula na lâmina para cobrir as larvas dissecadas lenta e suavemente para evitar bolhas.
4. Aplique o esmalte de unha ao redor da tampa. Coloque a lâmina no espaço escuro para reduzir a atenuação fluorescente.

5. Aquisição de imagens

1. Para a aquisição das imagens, utilizar microscópio confocal de varredura a laser, selecionar a objetiva de imersão em óleo 60x (abertura numérica 1,42) ou similar e ajustar a potência e o comprimento de onda do laser com base no experimento.
2. Para identificar o NMJ, captar imagens no músculo 4 no segmento A3 (como mostra a localização na Figura 1F). Selecione um laser de 488 nm para ativar a α-tubulina ou Futsch e 543 nm para ativar a trilha de imagem HRP. Ajuste os parâmetros para um tamanho de quadro de 800 pixels x 800 pixels, um zoom digital de 2,0 e um intervalo de imagem de 0,8 μm em NMJs (Figura 2).
3. Para identificar os microtúbulos no músculo, capture imagens do músculo 2 no segmento A3-A5 (como mostrado no local na Figura 1G) por apresentar menor número de ramos traqueais. Escolha um laser de 488 nm para ativar a α-tubulina e um laser de 635 nm para ativar a trilha de imagem T3605. Ajuste os parâmetros para um tamanho de quadro de 1024 pixels x 1024 pixels, um zoom digital de 3,0 e um intervalo de imagem de 0,4 μm nas células musculares (Figura 3).

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Resultados

Demonstramos um procedimento passo a passo para visualizar a rede de microtúbulos nas junções neuromusculares (NMJs) e nas células musculares. Após a dissecção de acordo com o diagrama esquemático (Figura 1A-E), a imunomarcação é realizada e, posteriormente, as imagens são observadas e coletadas em microscópio confocal a laser ou microscópio de fluorescência estereoscópica (Figura 1F,G).

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Discussão

Aqui é descrito um protocolo para a dissecção e imunomarcação de larvas de Drosophila , junções neuromusculares e células musculares. Há vários pontos essenciais a serem considerados. Em primeiro lugar, evitar a lesão dos músculos observados é crucial durante o processo de dissecção. Pode valer a pena fixar o filé antes de retirar os órgãos internos para evitar o contato direto entre a pinça e os músculos. Para evitar danos musculares ou separação da epiderme larval, é importante garantir ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342