ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

要約

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ ジョウバエのmelanogasterの強力な遺伝用具と結合されて、このプロトコルは神経系のmicrotubuleネットワークの規定蛋白質の役割のための遺伝のスクリーニングそしてmicrotubule原動力の分析を非常に促進する。

要約

微小管ネットワークは、神経系の不可欠な構成要素です。多くの微小管調節タンパク質の変異は、神経発達障害や神経疾患に関連しており、微小管関連タンパク質タウから神経変性疾患、微小管切断タンパク質スパスチンおよびカタニン60は、それぞれ遺伝性痙性対麻痺および神経発達異常を引き起こします。神経細胞内の微小管ネットワークの検出は、神経疾患の病態解明に有利である。しかし、ニューロンのサイズが小さく、軸索微小管束が密集しているため、微小管ネットワークの可視化は困難です。本研究では、ショウジョウバエの微小管ネットワークを可視化するために、幼虫の神経筋接合部と筋細胞を解剖し、α-チューブリンと微小管関連タンパク質Futschの免疫染色を行う方法について述べる。神経筋接合部はシナプス前部とシナプス後部の両方の微小管を観察することを可能にし、ショウジョウバエ幼虫の筋肉細胞のサイズは微小管ネットワークの明瞭な可視化を可能にします。本研究では、ショウジョウバエのカタニン60を変異させて過剰発現させ、神経筋接合部や筋細胞の微小管ネットワークを調べることで、神経発達におけるカタニン60の制御的役割を正確に明らかにしました。従って、ショウジョウバエのmelanogasterの強力な遺伝用具と結合されて、このプロトコルは神経系のmicrotubuleネットワークの規定する蛋白質の役割のための遺伝のスクリーニングそしてmicrotubuleの原動力の分析を非常に促進する。

概要

微小管(MT)は、細胞骨格を構成する構成要素の1つとして、細胞分裂、細胞増殖と運動性、細胞内輸送、細胞形状の維持など、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。微小管の動態と機能は、MAP1、MAP2、タウ、カタニン、キ^{ネシンなどの}他のタンパク質との相互作用によって調節されます1,2,3,4,5。

ニューロンでは、微小管は軸索と樹状突起の発達と維持に不可欠です。微小管の異常は、機能不全やニューロンの死さえも引き起こします。例えば、アルツハイマー病患者の脳では、タウタンパク質の過剰リン酸化により微小管ネットワークの安定性が低下し、神経学的不規則性が引き起こされます⁶。したがって、微小管ネットワークを調べることは、神経発達と神経疾患の病因の理解に貢献します。

神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロンの軸索末端と筋線維の間に形成される末梢シナプスであり、シナプスの構造と機能を研究するための優れた強力なモデルシステムです

プロトコル

1.幼虫の解剖

注:解剖液の血リンパ様生理食塩水(HL3.1)¹⁸と固定液4%パラホルムアルデヒド(PFA)^19,20は、温度が低すぎると微小管が解重合するため、室温で使用します。

1. 長い鈍い鉗子を持つ徘徊する3^番目の 幼虫を選びます。HL3.1で洗浄し、実体顕微鏡下の解剖皿に置きます。
   注:徘徊する第3齢幼虫は、枝分かれした前気孔によって識別され、約96時間(25°C)²¹で管の周りを這います。
2. 背側または腹側を上にして幼虫を配置します。背側は2本の長い気管で、腹側は腹部の歯状突起帯で識別します。
   1. 観察する組織に応じて、背側または腹側の解剖を選択します。これにより、特定の対象領域をより正確かつ詳細に表示できます。NMJと筋細胞の観察のために、幼虫の背側と腹側をそれぞれ切り開きます。
3. 口のフックと尻尾をピンで留めます。ピンを調整して、幼虫を伸ばした状態に保ちます。幼虫が乾燥するのを防ぐために、HL3.1を一滴加えます。
   注:Ca²⁺ -free HL 3.1は、....

ディスカッション

ここでは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部および筋肉細胞の解剖および免疫染色に関するプロトコルについて説明します。考慮すべき重要なポイントがいくつかあります。まず、解剖プロセスでは、観察された筋肉の損傷を避けることが重要です。鉗子と筋肉の直接接触を防ぐために、内臓を切除する前にフィレットを固定する価値があるかもしれません。筋肉の損傷や幼?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342