Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Resumen

La red de microtúbulos es un componente esencial del sistema nervioso. Las mutaciones en muchas proteínas reguladoras de los microtúbulos se asocian con trastornos del neurodesarrollo y enfermedades neurológicas, como la proteína Tau asociada a microtúbulos a enfermedades neurodegenerativas, la proteína cortante de microtúbulos Spastin y Katanin 60 causan paraplejia espástica hereditaria y anomalías del neurodesarrollo, respectivamente. La detección de redes de microtúbulos en las neuronas es ventajosa para dilucidar la patogénesis de los trastornos neurológicos. Sin embargo, el pequeño tamaño de las neuronas y la densa disposición de los haces de microtúbulos axonales dificultan la visualización de las redes de microtúbulos. En este estudio, describimos un método para la disección de la unión neuromuscular larvaria y las células musculares, así como la inmunotinción de α-tubulina y la proteína Futsch asociada a microtúbulos para visualizar redes de microtúbulos en Drosophila melanogaster. La unión neuromuscular nos permite observar los microtúbulos pre y postsinápticos, y el gran tamaño de las células musculares en la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Aquí, mutando y sobreexpresando Katanin 60 en Drosophila melanogaster, y luego examinando las redes de microtúbulos en la unión neuromuscular y las células musculares, revelamos con precisión el papel regulador de Katanin 60 en el neurodesarrollo. Por lo tanto, combinado con las poderosas herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Introducción

Los microtúbulos (MT), como uno de los componentes estructurales del citoesqueleto, desempeñan un papel importante en diversos procesos biológicos, incluida la división celular, el crecimiento y la motilidad celular, el transporte intracelular y el mantenimiento de la forma celular. La dinámica y la función de los microtúbulos están moduladas por interacciones con otras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin y Kinesin 1,2,3,4,5.

En las neuronas, los microtúbulos son esenciales para el desarrollo y mantenimiento de axones y dendritas. Las anomalías en los microtúbulos conducen a la disfunción e incluso a la muerte de las neuronas. Por ejemplo, en el cerebro de los pacientes con Alzheimer, la hiperfosforilación de la proteína Tau reduce la estabilidad de la red de microtúbulos, causando irregularidades neurológicas⁶. Por lo tanto, el examen de las redes de microtúbulos contribuirá a la comprensión del neurodesarrollo y la patogénesis de las enfermedades neurológicas.

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica formada entre el terminal axonal de una neurona motora y una fibra muscular, que es un excelente y potente sistema modelo para estudiar la estructura y las funciones sinápticas⁷. Futsch es una proteína de Drosophila que es homóloga a la proteína de unión a microtúbulos MAP1B que se encuentra en los mamíferos⁸. Se expresa solamente en las neuronas y desempeña un papel en el desarrollo de los botones sinápticos de la NMJ ^8,9. En el tipo salvaje, los haces filamentosos que corren a lo largo del centro de los procesos NMJ se visualizan mediante inmunotinción con anti-Futsch. Al llegar al final de NMJ, este haz tiene la capacidad de formar un bucle formado por microtúbulos o de perder su estructura filamentosa, lo que da lugar a un aspecto difuso y punteado¹⁰. Los bucles de microtúbulos se asocian con conos de crecimiento en pausa, lo que sugiere que la matriz de microtúbulos es estable¹¹. Por lo tanto, podemos determinar indirectamente el desarrollo estable de microtúbulos en NMJ mediante tinción de Futsch. El gran tamaño de las células musculares de la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Los factores que afectan la estabilidad de la red de microtúbulos se pueden encontrar analizando la densidad y la forma de los microtúbulos. Al mismo tiempo, el estado de la red de microtúbulos de las células musculares se puede verificar de forma cruzada con el resultado de la NMJ para obtener conclusiones más completas.

Se han empleado muchos protocolos para investigar la red y la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, estas investigaciones muchas veces se han centrado en estudios in vitro 12,13,14,15,16. Alternativamente, algunos experimentos in vivo han empleado microscopía electrónica para detectar el citoesqueleto¹⁷. De acuerdo con la unión específica de anticuerpos marcados con fluorescencia o colorantes químicos a proteínas o ADN, los métodos aquí presentados permiten la detección de redes de microtúbulos en NMJ a nivel de neuronas individuales in vivo, con resultados corroborados por observaciones en células musculares. Este protocolo es simple, estable y repetible cuando se combina con las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila melanogaster, lo que permite una amplia gama de exámenes fenotípicos y exámenes genéticos para el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso in vivo.

Protocolo

1. Disección de larvas

NOTA: La solución diseccionadora de solución salina similar a la hemolinfa (HL3.1)¹⁸ y la solución de fijación al 4% de paraformaldehído (PFA)^19,20 se utilizan a temperatura ambiente porque los microtúbulos se despolimerizan cuando la temperatura es demasiado baja.

1. Escoge una larva errante de^3er estadio con pinzas largas y romas. Lávelo con HL3.1 y colóquelo en la placa de disección bajo el microscopio estereoscópico.
   NOTA: La larva errante del^3er estadio se identifica por el espiráculo anterior ramificado y se arrastra alrededor del tubo aproximadamente a 96 h (25 °C)²¹.
2. Coloque la larva con el lado dorsal o ventral hacia arriba. Identifique el lado dorsal por las dos tráqueas largas y el ventral por los cinturones dentículos abdominales.
   1. Dependiendo del tejido a observar, opta por la disección dorsal o ventral. Esto permitirá una visión más precisa y detallada del área específica de interés. Para la observación de la NMJ y de las células musculares, abra las regiones dorsal y ventral de las larvas, respectivamente.
3. Sujeta con alfileres los ganchos de la boca y la cola. Ajuste los alfileres para mantener la larva en un estado prolongado. Añade una gota de HL3.1 a la larva para evitar que se seque.
   NOTA: Se puede utilizar HL 3.1 libre de Ca²⁺ para minimizar la contracción de los músculos durante la disección.
4. Use las tijeras de disección para hacer un pequeño corte transversal cerca del extremo posterior, pero no corte el extremo posterior. Luego corte a lo largo de la línea media ventral hacia el extremo anterior.
5. Inserte cuatro alfileres de insectos en las cuatro esquinas de la larva. Reajuste los alfileres de insectos de modo que la larva se estire al máximo en todas las direcciones.
6. Use las pinzas para extirpar los órganos internos sin dañar los músculos.

2. Fijación

1. Añadir 100 μL de PFA (4%) para sumergir las canales durante 40 minutos mientras las canales aún están fijadas en la placa de disección.
   PRECAUCIÓN: Se toman medidas de protección efectivas para evitar el contacto directo con la piel o la inhalación, ya que el PFA es un peligro.
2. Desmonte los pasadores y transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Enjuague el PFA con 1 solución salina tamponada con fosfato que contenga 0,2 % de Triton X-100 (0,2 % PBST) para llenar el tubo de microcentrífuga de 2 ml durante 10 min en el agitador decolorante a 15 rpm. Repita el proceso de lavado 5 veces.

3. Inmunocitoquímica

1. Sumergir las canales en agente bloqueante (suero de cabra al 5% en PBST al 0,2%) y bloquear durante 40 min a temperatura ambiente.
2. Retirar el agente bloqueante y sustituirlo por 200 μL del anticuerpo primario (p. ej., anti-α-tubulina, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) diluido con PBST al 0,2% a 4 °C durante la noche. Visualizar los microtúbulos musculares mediante inmunotinción con anti-α-tubulina monoclonal. El anti-Futsch puede reflejar indirectamente la morfología de los microtúbulos en la NMJ.
3. Después de la incubación del anticuerpo primario, lavar las larvas con PBST al 0,2% durante 10 min. Repetir 5 veces.
4. Incubar las larvas con 200 μL de anticuerpo secundario (p. ej., anti-Mouse-488 de cabra, 1:1000) diluido con PBST al 0,2% a temperatura ambiente durante 1,5 h en la oscuridad.
5. A continuación, agregue un colorante nuclear como yoduro TO-PRO(R) 3 (T3605) a una concentración de 1:1000 en el tubo de incubación durante 30 min al teñir los microtúbulos en la oscuridad^20,22.
6. Enjuague el anticuerpo secundario y el colorante nuclear con PBST al 0,2% durante 10 min. Repita 5 veces en la oscuridad.

4. Montaje

1. Coloque el cadáver de la larva en PBST al 0,2% en un portaobjetos de vidrio y ajústelo bajo el microscopio estereoscópico. Asegúrese de que la superficie interna del cadáver de la larva esté hacia arriba y que todos los cadáveres de las larvas estén dispuestos como se desee.
2. Absorba el exceso de solución PBST con una toallita y agregue suavemente una gota de medio de montaje antidecoloración.
3. Coloque un cubreobjetos en el portaobjetos para cubrir las larvas disecadas lenta y suavemente para evitar burbujas.
4. Aplica esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos. Coloque el portaobjetos en el espacio oscuro para reducir la atenuación fluorescente.

5. Adquisición de imágenes

1. Para adquirir las imágenes, utilice un microscopio confocal de barrido láser, seleccione el objetivo de inmersión en aceite de 60x (apertura numérica 1,42) o similar, y ajuste la potencia del láser y la longitud de onda en función del experimento.
2. Para identificar la NMJ, capture imágenes en el músculo 4 en el segmento A3 (como se muestra en la ubicación de la Figura 1F). Seleccione un láser de 488 nm para activar la α-tubulina o Futsch y 543 nm para activar la pista de imágenes HRP. Ajuste los parámetros a un tamaño de fotograma de 800 píxeles x 800 píxeles, un zoom digital de 2,0 y un intervalo de imagen de 0,8 μm en NMJ (Figura 2).
3. Para identificar los microtúbulos en el músculo, capture imágenes del músculo 2 en el segmento A3-A5 (como se muestra en la ubicación de la Figura 1G) ya que tiene menos ramas traqueales. Elija un láser de 488 nm para activar la α-tubulina y un láser de 635 nm para activar la pista de imágenes T3605. Ajuste los parámetros a un tamaño de fotograma de 1024 píxeles x 1024 píxeles, un zoom digital de 3,0 y un intervalo de imagen de 0,4 μm en células musculares (Figura 3).

Resultados

Demostramos un procedimiento paso a paso para visualizar la red de microtúbulos tanto en las uniones neuromusculares (NMJ) como en las células musculares. Después de la disección de acuerdo con el diagrama esquemático (Figura 1A-E), se realiza la inmunotinción y posteriormente se observan las imágenes y se recogen bajo un microscopio confocal láser o un microscopio de fluorescencia estereoscópica (Figura 1F, G).

Discusión

Aquí se describe un protocolo para la disección e inmunotinción de las uniones neuromusculares y las células musculares de las larvas de Drosophila . Hay varios puntos esenciales a tener en cuenta. En primer lugar, evitar lesiones en los músculos observados es crucial durante el proceso de disección. Puede valer la pena arreglar el filete antes de extraer los órganos internos para evitar el contacto directo entre las pinzas y los músculos. Para evitar daños musculares o la separación de la epidermis la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342