A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى
In This Article
Summary
يوفر البروتوكول نهجا موثوقا ومحسنا لعزل النوى من عينات الورم الصلبة لتسلسل الجينوم المتعدد باستخدام منصة 10x Genomics ، بما في ذلك التوصيات الخاصة بظروف تفكك الأنسجة ، والحفظ بالتبريد لمعلقات الخلية المفردة ، وتقييم النوى المعزولة.
Abstract
يمثل تسلسل Multiome ، الذي يوفر الحمض النووي الريبي أحادي الخلية / المقترن - ومقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع بيانات التسلسل (تسلسل ATAC) ، طفرة في قدرتنا على تمييز عدم تجانس الخلايا السرطانية - وهو التركيز الأساسي لأبحاث السرطان الانتقالية في هذا الوقت. ومع ذلك ، فإن جودة بيانات التسلسل التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة المتقدمة تعتمد بشكل كبير على جودة المواد المدخلة.
يجب تحسين ظروف الهضم لزيادة إنتاجية الخلايا دون التضحية بالجودة. هذا أمر صعب بشكل خاص في سياق الأورام الصلبة ذات المصفوفات البلاستيكية الكثيفة التي يجب تكسيرها بلطف لإطلاق الخلايا. الخلايا المعزولة حديثا من أنسجة الورم الصلبة أكثر هشاشة من تلك المعزولة من خطوط الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن أنواع الخلايا المعزولة غير متجانسة ، يجب اختيار الظروف لدعم إجمالي عدد الخلايا.
وأخيرا، يجب تحسين ظروف العزل النووي استنادا إلى هذه الصفات من حيث أوقات التحلل وأنواع/نسب الكواشف. في هذه المقالة ، نصف تجربتنا مع العزل النووي لمنصة تسلسل الجينوم المتعدد 10x Genomics من عينات الورم الصلب. نحن نقدم توصيات لهضم الأنسجة ، وتخزين معلقات الخلية الواحدة (إذا رغبت في ذلك) ، والعزل النووي والتقييم.
Introduction
مع نمو معرفتنا ببيولوجيا الورم ، زادت أيضا أهمية تحليل الخلايا غير المتجانسة عبر البيئة المكروية للورم 1,2. توفر القدرة على الحصول على الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ومقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع بيانات التسلسل (تسلسل ATAC) من نفس الخلية بطريقة الخلايا المزدوجة (تسلسل multiome) تقدما كبيرا نحو هذه الغاية 3,4. ومع ذلك ، فإن هذه التجارب مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وتعتمد جودة وتأثير البيانات المكتسبة بشكل كبير على جودة الظروف والمواد التجريبية. تم نشر بروتوكولات موحدة لعزل النوى 5,6
Protocol
تم الحصول على عينات من سرطان البنكرياس البشري (سرطان البنكرياس الغدي القنوي) وفقا لبروتوكول معتمد من IRB في مختبرنا. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى لجمع الأنسجة. تم نقل الأنسجة من غرفة العمليات إلى المختبر ثم معالجتها على النحو التالي.
1. تفكك الأنسجة (الهضم)
- إعداد المخزن المؤقت للهضم (انظر جدول المواد).
- الحصول على الأنسجة ذات الأهمية في أقرب وقت ممكن بعد استئصال الورم ونقل العينة في العازلة إخماد (DMEM F-12 مع ~ 5٪ مصل بقري الجنين) أو 1x PBS على الجليد.
- فرم الأنسجة باستخدام ملقط ومقص نظيف في 3-5 مل من Digest Buffer في طبق بتري 90 مم (الشكل 2 أ
النتائج
لعزل النوى عالية الجودة من عينات الورم الصلبة للمريض لتسلسل متعدد الomeات (الشكل 1) ، تم فصل أنسجة الورم وتم حفظ تعليق خلية واحدة بالتبريد (الشكل 2A-D). ثم تم إذابة تعليق الخلية في وقت التقاط multiome المخطط له. تم إجراء التقاط النوى باستخدام كواشف .......
Discussion
يعد فك تشابك مجموعات الخلايا غير المتجانسة الموجودة في البيئة المكروية للورم مجالا نشطا للتركيز في بيولوجيا السرطان. وبالمثل ، توجد الأنسجة المعقدة في الأمراض الحميدة مثل التئام الجروح والتليف. برز تسلسل Multiome كأداة قوية تسمح بالحصول على بيانات scRNA- و ATAC-seq المقترنة بنفس الخلية. يصف هذا الب.......
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن تقديرنا لمرفق ستانفورد للجينوم الوظيفي (SFGF) ، ولا سيما دانانجاي واغ وجون كولر ، و 10x Genomics لمساعدتهم في تحسين تجاربنا. نود أيضا أن نشكر الدكاترة جورج بولتسايد ومونيكا دوا وبريندان فيسر وبيرن لي على مساعدتهم في الحصول على عينات المرضى. نود أن نعرب عن تقديرنا لآرت وإلين تايلور ، ومؤسسة رانتز ، ووارن وجودي كابلان لدعمهم السخي لجهودنا البحثية. تشمل مصادر التمويل منح المعاهد الوطنية للصحة 1F32CA23931201A1 (D.S.F.) ، 1R01GM116892 (M.T.L.) ، 1R01GM136659 (M.T.L) ، مؤسسة جولدمان ساكس (J.A.N. ، D.S.F. ، M.T.L.) ، مؤسسة دامون رونيون لأبحاث السرطان (D.D. ، M.T.L.) ، صندوق Gunn / Olivier ، معهد كاليفورنيا للطب التجديدي ، مؤسسة Stinehart / Reed ، ومختبر Hagey ....
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
- Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).
- Sahai, E., et al.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved