A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر البروتوكول نهجا موثوقا ومحسنا لعزل النوى من عينات الورم الصلبة لتسلسل الجينوم المتعدد باستخدام منصة 10x Genomics ، بما في ذلك التوصيات الخاصة بظروف تفكك الأنسجة ، والحفظ بالتبريد لمعلقات الخلية المفردة ، وتقييم النوى المعزولة.

Abstract

يمثل تسلسل Multiome ، الذي يوفر الحمض النووي الريبي أحادي الخلية / المقترن - ومقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع بيانات التسلسل (تسلسل ATAC) ، طفرة في قدرتنا على تمييز عدم تجانس الخلايا السرطانية - وهو التركيز الأساسي لأبحاث السرطان الانتقالية في هذا الوقت. ومع ذلك ، فإن جودة بيانات التسلسل التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة المتقدمة تعتمد بشكل كبير على جودة المواد المدخلة.

يجب تحسين ظروف الهضم لزيادة إنتاجية الخلايا دون التضحية بالجودة. هذا أمر صعب بشكل خاص في سياق الأورام الصلبة ذات المصفوفات البلاستيكية الكثيفة التي يجب تكسيرها بلطف لإطلاق الخلايا. الخلايا المعزولة حديثا من أنسجة الورم الصلبة أكثر هشاشة من تلك المعزولة من خطوط الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن أنواع الخلايا المعزولة غير متجانسة ، يجب اختيار الظروف لدعم إجمالي عدد الخلايا.

وأخيرا، يجب تحسين ظروف العزل النووي استنادا إلى هذه الصفات من حيث أوقات التحلل وأنواع/نسب الكواشف. في هذه المقالة ، نصف تجربتنا مع العزل النووي لمنصة تسلسل الجينوم المتعدد 10x Genomics من عينات الورم الصلب. نحن نقدم توصيات لهضم الأنسجة ، وتخزين معلقات الخلية الواحدة (إذا رغبت في ذلك) ، والعزل النووي والتقييم.

Introduction

مع نمو معرفتنا ببيولوجيا الورم ، زادت أيضا أهمية تحليل الخلايا غير المتجانسة عبر البيئة المكروية للورم 1,2. توفر القدرة على الحصول على الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ومقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع بيانات التسلسل (تسلسل ATAC) من نفس الخلية بطريقة الخلايا المزدوجة (تسلسل multiome) تقدما كبيرا نحو هذه الغاية 3,4. ومع ذلك ، فإن هذه التجارب مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وتعتمد جودة وتأثير البيانات المكتسبة بشكل كبير على جودة الظروف والمواد التجريبية. تم نشر بروتوكولات موحدة لعزل النوى 5,6

Protocol

تم الحصول على عينات من سرطان البنكرياس البشري (سرطان البنكرياس الغدي القنوي) وفقا لبروتوكول معتمد من IRB في مختبرنا. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى لجمع الأنسجة. تم نقل الأنسجة من غرفة العمليات إلى المختبر ثم معالجتها على النحو التالي.

1. تفكك الأنسجة (الهضم)

  1. إعداد المخزن المؤقت للهضم (انظر جدول المواد).
  2. الحصول على الأنسجة ذات الأهمية في أقرب وقت ممكن بعد استئصال الورم ونقل العينة في العازلة إخماد (DMEM F-12 مع ~ 5٪ مصل بقري الجنين) أو 1x PBS على الجليد.
  3. فرم الأنسجة باستخدام ملقط ومقص نظيف في 3-5 مل من Digest Buffer في طبق بتري 90 مم (الشكل 2 أ

النتائج

لعزل النوى عالية الجودة من عينات الورم الصلبة للمريض لتسلسل متعدد الomeات (الشكل 1) ، تم فصل أنسجة الورم وتم حفظ تعليق خلية واحدة بالتبريد (الشكل 2A-D). ثم تم إذابة تعليق الخلية في وقت التقاط multiome المخطط له. تم إجراء التقاط النوى باستخدام كواشف .......

Discussion

يعد فك تشابك مجموعات الخلايا غير المتجانسة الموجودة في البيئة المكروية للورم مجالا نشطا للتركيز في بيولوجيا السرطان. وبالمثل ، توجد الأنسجة المعقدة في الأمراض الحميدة مثل التئام الجروح والتليف. برز تسلسل Multiome كأداة قوية تسمح بالحصول على بيانات scRNA- و ATAC-seq المقترنة بنفس الخلية. يصف هذا الب.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن تقديرنا لمرفق ستانفورد للجينوم الوظيفي (SFGF) ، ولا سيما دانانجاي واغ وجون كولر ، و 10x Genomics لمساعدتهم في تحسين تجاربنا. نود أيضا أن نشكر الدكاترة جورج بولتسايد ومونيكا دوا وبريندان فيسر وبيرن لي على مساعدتهم في الحصول على عينات المرضى. نود أن نعرب عن تقديرنا لآرت وإلين تايلور ، ومؤسسة رانتز ، ووارن وجودي كابلان لدعمهم السخي لجهودنا البحثية. تشمل مصادر التمويل منح المعاهد الوطنية للصحة 1F32CA23931201A1 (D.S.F.) ، 1R01GM116892 (M.T.L.) ، 1R01GM136659 (M.T.L) ، مؤسسة جولدمان ساكس (J.A.N. ، D.S.F. ، M.T.L.) ، مؤسسة دامون رونيون لأبحاث السرطان (D.D. ، M.T.L.) ، صندوق Gunn / Olivier ، معهد كاليفورنيا للطب التجديدي ، مؤسسة Stinehart / Reed ، ومختبر Hagey ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers  ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)10x Genomics2000153/2000207
Bambanker Wako, Fisher ScientiticNC9582225 
BSAMiltenyi Biotec130-091-376
Calcium ChlorideSigma Aldrich499609
Collagenase (Collagenase Type IV)ThermoFisher17104019
DigitoninThermo FisherBN2006
DNase IWorthingtonLS006330
DTTSigma Aldrich646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12Thermo Fisher11320082
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer Sigma AldrichBAH136800040
HEPESSigma AldrichH3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solutionSigma Aldrich11191
Medium 199Sigma AldrichM2520
MgCl2Sigma AldrichM1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit 
NaClSigma Aldrich59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container ThermoFisher5100-0001
Nonident P40 SubstituteSigma Aldrich74385
Poloxamer 188SigmaP5556
Rnase inhibitor Sigma Aldrich3335399001
Tris-HClSigma AldrichT2194
Tween-20Thermo Fisher85113

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ATAC 10x Multiome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved