عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

Summary

يوفر البروتوكول نهجا موثوقا ومحسنا لعزل النوى من عينات الورم الصلبة لتسلسل الجينوم المتعدد باستخدام منصة 10x Genomics ، بما في ذلك التوصيات الخاصة بظروف تفكك الأنسجة ، والحفظ بالتبريد لمعلقات الخلية المفردة ، وتقييم النوى المعزولة.

Abstract

يمثل تسلسل Multiome ، الذي يوفر الحمض النووي الريبي أحادي الخلية / المقترن - ومقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع بيانات التسلسل (تسلسل ATAC) ، طفرة في قدرتنا على تمييز عدم تجانس الخلايا السرطانية - وهو التركيز الأساسي لأبحاث السرطان الانتقالية في هذا الوقت. ومع ذلك ، فإن جودة بيانات التسلسل التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة المتقدمة تعتمد بشكل كبير على جودة المواد المدخلة.

يجب تحسين ظروف الهضم لزيادة إنتاجية الخلايا دون التضحية بالجودة. هذا أمر صعب بشكل خاص في سياق الأورام الصلبة ذات المصفوفات البلاستيكية الكثيفة التي يجب تكسيرها بلطف لإطلاق الخلايا. الخلايا المعزولة حديثا من أنسجة الورم الصلبة أكثر هشاشة من تلك المعزولة من خطوط الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن أنواع الخلايا المعزولة غير متجانسة ، يجب اختيار الظروف لدعم إجمالي عدد الخلايا.

وأخيرا، يجب تحسين ظروف العزل النووي استنادا إلى هذه الصفات من حيث أوقات التحلل وأنواع/نسب الكواشف. في هذه المقالة ، نصف تجربتنا مع العزل النووي لمنصة تسلسل الجينوم المتعدد 10x Genomics من عينات الورم الصلب. نحن نقدم توصيات لهضم الأنسجة ، وتخزين معلقات الخلية الواحدة (إذا رغبت في ذلك) ، والعزل النووي والتقييم.

Introduction

مع نمو معرفتنا ببيولوجيا الورم ، زادت أيضا أهمية تحليل الخلايا غير المتجانسة عبر البيئة المكروية للورم ^1,2. توفر القدرة على الحصول على الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ومقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع بيانات التسلسل (تسلسل ATAC) من نفس الخلية بطريقة الخلايا المزدوجة (تسلسل multiome) تقدما كبيرا نحو هذه الغاية ^3,4. ومع ذلك ، فإن هذه التجارب مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وتعتمد جودة وتأثير البيانات المكتسبة بشكل كبير على جودة الظروف والمواد التجريبية. تم نشر بروتوكولات موحدة لعزل النوى ^5,6. تتطلب الأنسجة الطازجة وغير المتجانسة تحسين البروتوكول لأن الخلايا المعزولة حديثا من عينات الورم الصلبة أكثر هشاشة من تلك المعزولة من خطوط الخلايا.

هناك اعتبار آخر وهو أنه بالنسبة للأورام الصلبة ، غالبا ما لا تتوفر العينات الجراحية من غرفة العمليات حتى وقت متأخر من اليوم. على هذا النحو ، ليس من الممكن عموما الانتقال مباشرة من الحصول على العينات إلى التقاط النوى دون خطوة الحفظ بالتبريد. في تجربتنا ، ينتج عن تجميد معلق أحادي الخلية نوى عالية الجودة (بدلا من الأنسجة الكاملة المجمدة أو طرق الحفظ الأخرى). هذا ينطبق بشكل خاص على أنواع الأنسجة الأنزيمية التي تحتوي على نسبة عالية من RNase مثل البنكرياس.

يجب أيضا تصميم ظروف هضم الأنسجة لزيادة إنتاجية الخلايا إلى أقصى حد دون التضحية بالجودة⁷. في سياق أنواع الأورام الصلبة ذات المصفوفات البلاستيكية^{الكثيفة 8} ، يجب تقسيم المصفوفة خارج الخلية برفق لإطلاق الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن أنواع الخلايا المعزولة غير متجانسة ، يجب تعديل الظروف لدعم إجمالي عدد الخلايا. تستخدم عينات سرطان البنكرياس البشري (سرطان البنكرياس الغدي القنوي) في البروتوكول الموصوف. يمثل سرطان البنكرياس نوعا من الأورام شديدة التنسج ، والتي تنذر بأنسجة وخلايا لزجة نسبيا. علاوة على ذلك ، نظرا لأن عينات أورام البنكرياس المتاحة للبحث تميل أيضا إلى أن تكون صغيرة نسبيا ، تبذل الجهود لزيادة كمية الخلايا التي تم التقاطها.

يتطلب عزل النوى أكبر قدر من التحسين من حيث ظروف تحلل الخلية وتوقيتها ، وكذلك أنواع الكواشف ونسبها. يتطلب التعامل مع النوى على مدار العزلة أيضا عناية كبيرة. في هذه المقالة ، نصف تجربتنا في تحسين العزل النووي لمنصة تسلسل الجينوم المتعدد 10x من أنسجة الورم الصلبة (الشكل 1). نحن نقدم توصيات لهضم الأنسجة ، والحفظ بالتبريد للمعلقات أحادية الخلية (إذا رغبت في ذلك) ، والعزل النووي.

Protocol

تم الحصول على عينات من سرطان البنكرياس البشري (سرطان البنكرياس الغدي القنوي) وفقا لبروتوكول معتمد من IRB في مختبرنا. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى لجمع الأنسجة. تم نقل الأنسجة من غرفة العمليات إلى المختبر ثم معالجتها على النحو التالي.

1. تفكك الأنسجة (الهضم)

1. إعداد المخزن المؤقت للهضم (انظر جدول المواد).
2. الحصول على الأنسجة ذات الأهمية في أقرب وقت ممكن بعد استئصال الورم ونقل العينة في العازلة إخماد (DMEM F-12 مع ~ 5٪ مصل بقري الجنين) أو 1x PBS على الجليد.
3. فرم الأنسجة باستخدام ملقط ومقص نظيف في 3-5 مل من Digest Buffer في طبق بتري 90 مم (الشكل 2 أ).
4. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وانفصل في ~ 10 مل من Digest Buffer لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي مع وظيفة الاهتزاز أو محرض جاف.
5. إزالة من المحرض وإخماد مع ~ 20 مل من وسط التبريد. قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي نظيف.
6. اجمع أي أنسجة صلبة متبقية من المصفاة (أعد فرم قطع الأنسجة المتبقية إذا لزم الأمر) ، وضعها في ~ 10 مل من Digest Buffer الطازج لمدة 30 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية مع التقليب. كرر حتى يتم فصل جميع أنسجة الورم.
7. يتم ترشيح حصص تعليق خلايا البركة وتصفيتها من خلال 70 ميكرومتر متبوعة بمصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي نظيف على الجليد.
8. أجهزة الطرد المركزي إلى خلايا الحبيبات عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ثم صب المادة الطافية.

2. الحفظ بالتبريد

1. شطف الخلايا عن طريق تعليق بيليه في 1 مل من 1x PBS.
2. نقل تعليق الخلية (~ 1-10 مليون خلية / أنبوب للتجميد الأمثل) إلى 1.5 مل cryovial على الجليد.
3. أجهزة الطرد المركزي لخلايا الحبيبات عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ثم صب المادة الطافية.
4. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول Bambanker ، وانقلها إلى 1.5 أو 2 مل كريوفيال (الشكل 2 ب) ، وقم بتجميدها باستخدام حاوية تجميد بمعدل تبريد -1 درجة مئوية / دقيقة (تحتوي على 100٪ كحول الأيزوبروبيل) عند -80 درجة مئوية ، أو نقلها إلى النيتروجين السائل إذا كان من المتوقع تخزين العينة على المدى الطويل.

3. عزل النوى

1. قم بإذابة الجليد بسرعة في تعليق الخلية ووضعه على الثلج الرطب.
2. انقل تعليق الخلية المذابة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل وقم بتعبئة القارورة إلى محلول 2 مل باستخدام 1x PBS لشطف الخلايا.
3. احصل على تعداد يدوي للخلايا باستخدام مقياس الدم لتقييم كل من كمية ونوعية الخلايا (الشكل 2C).
4. أجهزة الطرد المركزي إلى خلايا الحبيبات عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ثم صب المادة الطافية برفق باستخدام أطراف ماصة أصغر تدريجيا لتترك وراءها حبيبات جافة وتحافظ عليها على الجليد.
   1. استخدم دوار الجرافة المتأرجحة لجميع خطوات الطرد المركزي. للحصول على أقصى إنتاجية للخلية ، ضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي بحيث تكون المفصلة متجهة للخارج ثم صبها مع توجيه طرف الماصة نحو الجانب الآخر من الأنبوب (الشكل 2 د).
      ملاحظة: لصب المادة الطافية ، استخدم أطراف ماصة أصغر تدريجيا لإزالة السوائل للحد من تعطل الحبيبات مع زيادة حجم السائل المصبوغ. هذه الاستراتيجية مفيدة بشكل خاص لاحقا في البروتوكول التالي لاستخراج النوى لأن حبيبات النوى غير مرئية بشكل عام.
5. قم بإعداد 1x Cell Lysis Buffer ، و Cell Lysis Dilution Buffer ، و Wash Buffer (الشكل 3A) وفقا للبروتوكول المنشور مع التعديلات التالية (انظر الجدول 1 ، جدول المواد):
   ملاحظة: ضع الديجيتونين على كتلة تسخين عند 65 درجة مئوية قبل استخدامه لإذابة الراسب (الشكل 3 ب). يستغرق هذا عادة حوالي 10 دقائق.
6. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلية 0.1x من خلال الجمع بين 100 ميكرولتر من 1x Cell Lysis Buffer و 900 μL من Cell Lysis Dilution Buffer ، ماصة بلطف لخلطها ، ووضعها على الجليد.
7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية المبرد 0.1x وماصة برفق لخلط 5x.
8. احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق (الشكل 3C).
9. أضف 1 مل من Wash Buffer المبرد والماصة لأعلى ولأسفل لخلط 5x برفق.
10. أجهزة طرد مركزي لتكوير النوى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، صب المادة الطافية برفق على حبيبات جافة ، والحفاظ عليها على الجليد.
    ملاحظة: إذا كان رقم خلية البداية منخفضا (100000-200000 خلية) ، فقم بإجراء خطوات تحلل الخلية وغسلها في أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر بدلا من أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل لتقليل مساحة سطح الأنبوب وتقليل الخسائر. في هذه الحالة ، اضبط مستوى صوت Wash Buffer لأسفل لاستيعاب حجم الأنبوب الأصغر.
11. كرر الخطوات 3.9-3.10 2x ليصبح المجموع ثلاث غسلات.
12. عد النوى يدويا باستخدام شريحة مقياس الدم تحت المجهر. استخدم صبغة التريبان الزرقاء إذا رغبت في ذلك لتوفير التباين لعرض النوى وللمساعدة في تمييز النوى من الخلايا غير المحللة.
13. قم بإعداد 1x Nuclei Buffer وفقا للبروتوكول المنشور: مخزون 20x Nuclei Buffer ، 1 mM DTT ، 1 U / μL RNase Inhibitor في الماء الخالي من النيوكلياز واحتفظ به على الجليد (انظر جدول المواد).
14. أعد تعليق حبيبات النوى في 1x Nuclei Buffer بناء على استعادة النوى المستهدفة الهدف.
    ملاحظة: إذا كان التركيز مرتفعا بدرجة كافية، فاستهدف الاسترداد المستهدف بمقدار 10000 أو أعلى قليلا في هذه الخطوة (3230-8060 نواة/ميكرولتر) عند تحديد حجم إعادة التعليق في البداية، نظرا لفقدان الحجم المتوقع بمقدار 25 ميكرولتر وانخفاض التركيز بنسبة 20٪ مع الترشيح (الخطوة 3.15).
15. مرر حجم النوى المعاد تعليقه برفق من خلال مصفاة خلية طرف ماصة 40 ميكرومتر وضع النوى على الجليد (الشكل 3 د).
16. أعد عد النوى (الشكل 4A-C). قم بتخفيف المحلول النهائي بشكل أكبر باستخدام Nuclei Buffer إذا لزم الأمر.
17. انقل النوى على الجليد وتابع على الفور التقاط النوى وفقا للبروتوكولات المنشورة.

النتائج

لعزل النوى عالية الجودة من عينات الورم الصلبة للمريض لتسلسل متعدد الomeات (الشكل 1) ، تم فصل أنسجة الورم وتم حفظ تعليق خلية واحدة بالتبريد (الشكل 2A-D). ثم تم إذابة تعليق الخلية في وقت التقاط multiome المخطط له. تم إجراء التقاط النوى باستخدام كواشف ...

Discussion

يعد فك تشابك مجموعات الخلايا غير المتجانسة الموجودة في البيئة المكروية للورم مجالا نشطا للتركيز في بيولوجيا السرطان. وبالمثل ، توجد الأنسجة المعقدة في الأمراض الحميدة مثل التئام الجروح والتليف. برز تسلسل Multiome كأداة قوية تسمح بالحصول على بيانات scRNA- و ATAC-seq المقترنة بنفس الخلية. يصف هذا الب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113