Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung

Zusammenfassung

Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.

Zusammenfassung

Die Multiom-Sequenzierung, die gleichzellige/gepaarte Einzelzell-RNA und den Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierungsdaten (ATAC-Sequenzierung) liefert, stellt einen Durchbruch in unserer Fähigkeit dar, die Heterogenität von Tumorzellen zu erkennen - ein Hauptschwerpunkt der translationalen Krebsforschung zu dieser Zeit. Die Qualität der Sequenzierungsdaten, die mit dieser fortschrittlichen Modalität erfasst werden, hängt jedoch stark von der Qualität des Eingangsmaterials ab.

Die Verdauungsbedingungen müssen optimiert werden, um die Zellausbeute zu maximieren, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Dies ist eine besondere Herausforderung im Zusammenhang mit soliden Tumoren mit dichten desmoplastischen Matrizen, die für die Zellfreisetzung schonend abgebaut werden müssen. Frisch isolierte Zellen aus solidem Tumorgewebe sind zerbrechlicher als solche, die aus Zelllinien isoliert wurden. Da die isolierten Zelltypen heterogen sind, sollten außerdem Bedingungen ausgewählt werden, um die gesamte Zellpopulation zu unterstützen.

Schließlich müssen die Bedingungen für die nukleare Isolierung auf der Grundlage dieser Eigenschaften in Bezug auf Lysezeiten und Reagenzientypen/-verhältnisse optimiert werden. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Erfahrungen mit der Kernisolierung für die 10x Genomics Multiom-Sequenzierungsplattform aus soliden Tumorproben. Wir geben Empfehlungen für den Gewebeverdau, die Lagerung von Einzelzellsuspensionen (falls gewünscht) sowie die nukleare Isolierung und Bewertung.

Einleitung

Mit dem wachsenden Wissen über die Tumorbiologie hat auch die Bedeutung der Analyse heterogener Zellen in der Tumormikroumgebung zugenommen ^1,2. Die Möglichkeit, Einzelzell-RNA und den Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierungsdaten (ATAC-Sequenzierung) aus derselben Zelle in einer gepaarten Zellweise (Multiom-Sequenzierung) zu erfassen, stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Richtung dar ^3,4. Diese Experimente sind jedoch teuer und zeitaufwändig, und die Qualität und Wirkung der gewonnenen Daten hängen stark von der Qualität der Versuchsbedingungen und Materialien ab. Standardisierte Protokolle für die Zellkernisolierung wurden veröffentlicht ^5,6. Frische und heterogene Gewebe erfordern eine Optimierung des Protokolls, da frisch isolierte Zellen aus soliden Tumorproben zerbrechlicher sind als solche, die aus Zelllinien isoliert wurden.

Eine weitere Überlegung ist, dass bei soliden Tumoren chirurgische Proben oft erst spät am Tag aus dem Operationssaal zur Verfügung stehen. Daher ist es im Allgemeinen nicht möglich, ohne einen Kryokonservierungsschritt direkt von der Probenaufnahme zum Kerneinfang überzugehen. Unserer Erfahrung nach liefert das Einfrieren einer Einzelzellsuspension die hochwertigsten Zellkerne (im Gegensatz zu schockgefrorenem ganzem Gewebe oder anderen Konservierungsmodalitäten). Dies gilt insbesondere für enzymatische Gewebetypen mit hohem RNase-Gehalt wie die Bauchspeicheldrüse.

Auch die Bedingungen für die Gewebeverdauung müssen so gestaltet werden, dass die Zellausbeute maximiert wird, ohne die Qualität zu beeinträchtigen⁷. Im Zusammenhang mit soliden Tumortypen mit dichten desmoplastischen Matrizen⁸ muss die extrazelluläre Matrix für die Zellfreisetzung schonend aufgebrochen werden. Da die isolierten Zelltypen heterogen sind, sollten die Bedingungen angepasst werden, um die gesamte Zellpopulation zu unterstützen. In dem beschriebenen Protokoll werden Proben von menschlichem Bauchspeicheldrüsenkrebs (duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse) verwendet. Bauchspeicheldrüsenkrebs ist ein stark desmoplastischer Tumortyp, der auf relativ klebriges Gewebe und Zellen hindeutet. Da auch die für die Forschung verfügbaren Proben von Bauchspeicheldrüsentumoren in der Regel relativ klein sind, wird versucht, die Menge der erfassten Zellen zu maximieren.

Die Isolierung von Zellkernen erfordert die größte Optimierung in Bezug auf die Zelllysebedingungen und das Timing sowie die Reagenzientypen und -verhältnisse. Auch der Umgang mit den Zellkernen im Verlauf der Isolation erfordert große Sorgfalt. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Erfahrungen mit der Optimierung der Kernisolierung für die 10x Genomics Multiom-Sequenzierungsplattform aus solidem Tumorgewebe (Abbildung 1). Wir geben Empfehlungen für die Gewebeverdauung, die Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen (falls gewünscht) und die Kernisolierung.

Protokoll

Die Proben des menschlichen Bauchspeicheldrüsenkarzinoms (duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse) wurden nach einem vom IRB zugelassenen Protokoll in unserem Labor entnommen. Für die Gewebeentnahme wurde eine Einverständniserklärung der Patienten eingeholt. Das Gewebe wurde aus dem Operationssaal ins Labor transportiert und anschließend wie folgt aufbereitet.

1. Gewebedissoziation (Verdauung)

1. Bereiten Sie den Aufschlusspuffer vor (siehe Materialtabelle).
2. Entnehmen Sie das interessierende Gewebe so schnell wie möglich nach der Tumorexzision und transportieren Sie die Probe in Quenchpuffer (DMEM F-12 mit ~5% fötalem Kälberserum) oder 1x PBS auf Eis.
3. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sauberen Pinzette und Schere in 3-5 ml Digest Buffer in einer 90-mm-Petrischale (Abbildung 2A).
4. Das zerkleinerte Gewebe wird in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt und in ~10 mL Digest Buffer für 30 min bei 37 °C in einem Wasserbad mit Schüttelfunktion oder einem Trockenrührer dissoziiert.
5. Aus dem Rührwerk nehmen und mit ~20 ml Abschreckmedium abschrecken. Filtrieren Sie die Lösung durch ein 100-μm-Zellsieb in ein sauberes konisches Röhrchen.
6. Sammeln Sie das verbleibende feste Gewebe aus dem Sieb (zerkleinern Sie die verbleibenden Gewebestücke bei Bedarf erneut) und geben Sie es für weitere 30 Minuten bei 37 °C unter Rühren in ~10 ml frischen Digest Buffer. Wiederholen Sie den Vorgang, bis das gesamte Tumorgewebe dissoziiert ist.
7. Die Poolzellsuspension aliquotiert und filtriert durch ein 70 μm-Zellsieb, gefolgt von einem 40-μm-Zellsieb in ein sauberes, konisches Röhrchen auf Eis.
8. Zu Pelletzellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand dekantieren.

2. Kryokonservierung

1. Spülen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1 ml 1x PBS resuspendieren.
2. Die Zellsuspension (~1-10 Millionen Zellen/Röhrchen für optimales Einfrieren) in ein 1,5-ml-Kryoröhrchen auf Eis überführen.
3. Zu Pelletzellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand dekantieren.
4. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Bambanker-Lösung, überführen Sie sie in ein 1,5- oder 2-ml-Kryoröhrchen (Abbildung 2B) und frieren Sie sie in einem Gefrierbehälter mit einer Kühlrate von -1 °C/min (mit 100 % Isopropylalkohol) bei -80 °C ein oder überführen Sie sie in flüssigen Stickstoff, wenn eine längerfristige Lagerung der Probe zu erwarten ist.

3. Isolierung von Zellkernen

1. Tauen Sie das Kryoröhrchen der Zellsuspension schnell auf und legen Sie es auf nasses Eis.
2. Die aufgetaute Zellsuspension in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und das Fläschchen mit 1x PBS auf 2-ml-Lösung auffüllen, um die Zellen zu spülen.
3. Führen Sie eine manuelle Zellzählung mit einem Hämozytometer durch, um sowohl die Quantität als auch die Qualität der Zellen zu beurteilen (Abbildung 2C).
4. Zu Pelletzellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand vorsichtig mit immer kleineren Pipettenspitzen dekantieren, um ein trockenes Pellet zu hinterlassen und auf Eis zu halten.
   1. Verwenden Sie einen Schwenkrotor für alle Zentrifugationsschritte. Um eine maximale Zellausbeute zu erzielen, legen Sie die Röhrchen mit dem Scharnier nach außen in die Zentrifuge und dekantieren Sie sie dann mit der Pipettenspitze auf die gegenüberliegende Seite des Röhrchens (Abbildung 2D).
      HINWEIS: Verwenden Sie zum Umfüllen des Überstandes immer kleinere Pipettenspitzen, um Flüssigkeit zu entfernen, um die Unterbrechung des Pellets zu begrenzen und gleichzeitig das Volumen der dekantierten Flüssigkeit zu maximieren. Diese Strategie ist besonders hilfreich im späteren Verlauf des Protokolls nach der Kernextraktion, da das Kernpellet im Allgemeinen nicht sichtbar ist.
5. Bereiten Sie 1x Zelllysepuffer, Zelllyseverdünnungspuffer und Waschpuffer (Abbildung 3A) gemäß dem veröffentlichten Protokoll mit den folgenden Modifikationen vor (siehe Tabelle 1, Materialtabelle):
   HINWEIS: Legen Sie das Digitonin vor der Verwendung auf einen Heizblock bei 65 °C, um den Niederschlag aufzulösen (Abbildung 3B). Dies dauert in der Regel etwa 10 Minuten.
6. Bereiten Sie den 0,1-fachen Zelllysepuffer vor, indem Sie 100 μl 1-fachen Zelllysepuffer und 900 μl Zelllyse-Verdünnungspuffer mischen, vorsichtig zum Mischen pipettieren und auf Eis legen.
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl gekühltem 0,1-fachem Zelllysepuffer und pipettieren Sie vorsichtig zum 5-fachen Mischen.
8. 3 Minuten auf Eis inkubieren (Abbildung 3C).
9. Fügen Sie 1 ml gekühlten Waschpuffer hinzu und pipettieren Sie ihn auf und ab, um ihn vorsichtig 5x zu mischen.
10. Zentrifugieren, um die Kerne bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C zu pelletieren, den Überstand vorsichtig zu einem trockenen Pellet umfüllen und auf Eis belassen.
    HINWEIS: Wenn die Anzahl der Ausgangszellen niedrig ist (100.000-200.000 Zellen), führen Sie die Zelllyse- und Waschschritte in einem 200-μl-PCR-Röhrchen anstelle eines 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens durch, um die Röhrchenoberfläche zu verringern und Verluste zu minimieren. Stellen Sie in diesem Fall das Volumen des Waschpuffers nach unten ein, um das kleinere Volumen der Röhre aufzunehmen.
11. Wiederholen Sie die Schritte 3.9-3.10 2x für insgesamt drei Wäschen.
12. Zählen Sie die Zellkerne manuell mit einem Hämozytometer-Objektträger unter dem Mikroskop. Verwenden Sie auf Wunsch Trypanblau, um einen Kontrast für die Betrachtung der Zellkerne zu schaffen und Kerne von nicht lysierten Zellen zu unterscheiden.
13. Bereiten Sie den 1x Nuclei Buffer gemäß dem veröffentlichten Protokoll vor: 20x Nuclei Buffer Stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor in nukleasefreiem Wasser und bewahren Sie ihn auf Eis auf (siehe Materialtabelle).
14. Resuspendieren Sie das Kernpellet in 1x Nuclei Buffer basierend auf der zielgerichteten Kernrückgewinnung.
    HINWEIS: Wenn die Konzentration hoch genug ist, streben Sie bei der Bestimmung des anfänglichen Resuspensionsvolumens eine angestrebte Ausbeute von 10.000 oder etwas mehr bei diesem Schritt an (3.230-8.060 Kerne/μl), angesichts des erwarteten Volumenverlusts von 25 μl und der Abnahme der Konzentration um 20 % bei der Filterung (Schritt 3.15).
15. Führen Sie das resuspendierte Zellvolumen vorsichtig durch ein 40-μm-Pipettenspitzen-Zellsieb und legen Sie die Kerne auf Eis (Abbildung 3D).
16. Zählen Sie die Kerne nach (Abbildung 4A-C). Verdünnen Sie die endgültige Lösung bei Bedarf weiter mit Nuclei Buffer.
17. Transportieren Sie die Kerne auf Eis und fahren Sie sofort mit dem Einfangen der Kerne gemäß den veröffentlichten Protokollen fort.

Ergebnisse

Um qualitativ hochwertige Zellkerne aus soliden Tumorproben von Patienten für die Multiom-Sequenzierung zu isolieren (Abbildung 1), wurde das Tumorgewebe dissoziiert und eine Einzelzellsuspension kryokonserviert (Abbildung 2A-D). Die Zellsuspension wurde dann zum Zeitpunkt des geplanten Multiom-Einfangs aufgetaut. Der Zellkerneinfang wurde mit optimierten Lysepufferreagenzien und optimiertem Timing durchgeführt, um sowohl die ...

Diskussion

Die Entwirrung der heterogenen Zellpopulationen, die in der Mikroumgebung des Tumors vorhanden sind, ist ein aktives Schwerpunktgebiet der Krebsbiologie. In ähnlicher Weise existieren komplexe Gewebe bei gutartigen Pathologien wie Wundheilung und Fibrose. Die Multiom-Sequenzierung hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug entwickelt, das die Erfassung von gleichzelligen gepaarten scRNA- und ATAC-seq-Daten ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Zellkernen, die bei der Verarbeitung frischer, zerbrec...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113