Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung

Zusammenfassung

Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.

Zusammenfassung

Die Multiom-Sequenzierung, die gleichzellige/gepaarte Einzelzell-RNA und den Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierungsdaten (ATAC-Sequenzierung) liefert, stellt einen Durchbruch in unserer Fähigkeit dar, die Heterogenität von Tumorzellen zu erkennen - ein Hauptschwerpunkt der translationalen Krebsforschung zu dieser Zeit. Die Qualität der Sequenzierungsdaten, die mit dieser fortschrittlichen Modalität erfasst werden, hängt jedoch stark von der Qualität des Eingangsmaterials ab.

Die Verdauungsbedingungen müssen optimiert werden, um die Zellausbeute zu maximieren, ohne die Qualität zu beeinträchtigen. Dies ist eine besondere Herausforderung im Zusammenhang mit soliden Tumoren mit dichten desmoplastischen Matrizen, die für die Zellfreisetzung schonend abgebaut werden müssen. Frisch isolierte Zellen aus solidem Tumorgewebe sind zerbrechlicher als solche, die aus Zelllinien isoliert wurden. Da die isolierten Zelltypen heterogen sind, sollten außerdem Bedingungen ausgewählt werden, um die gesamte Zellpopulation zu unterstützen.

Schließlich müssen die Bedingungen für die nukleare Isolierung auf der Grundlage dieser Eigenschaften in Bezug auf Lysezeiten und Reagenzientypen/-verhältnisse optimiert werden. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Erfahrungen mit der Kernisolierung für die 10x Genomics Multiom-Sequenzierungsplattform aus soliden Tumorproben. Wir geben Empfehlungen für den Gewebeverdau, die Lagerung von Einzelzellsuspensionen (falls gewünscht) sowie die nukleare Isolierung und Bewertung.

Einleitung

Mit dem wachsenden Wissen über die Tumorbiologie hat auch die Bedeutung der Analyse heterogener Zellen in der Tumormikroumgebung zugenommen ^1,2. Die Möglichkeit, Einzelzell-RNA und den Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierungsdaten (ATAC-Sequenzierung) aus derselben Zelle in einer gepaarten Zellweise (Multiom-Sequenzierung) zu erfassen, stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Richtung dar ^3,4. Diese Experimente sind jedoch teuer und zeitaufwändig, und die Qualität und Wirkung der gewonnenen Daten hängen stark von der Qualit....

Protokoll

Die Proben des menschlichen Bauchspeicheldrüsenkarzinoms (duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse) wurden nach einem vom IRB zugelassenen Protokoll in unserem Labor entnommen. Für die Gewebeentnahme wurde eine Einverständniserklärung der Patienten eingeholt. Das Gewebe wurde aus dem Operationssaal ins Labor transportiert und anschließend wie folgt aufbereitet.

1. Gewebedissoziation (Verdauung)

1. Bereiten Sie den Aufschlusspuffer vor (siehe Materialtabelle).
2. Entnehmen Sie das interessierende Gewebe so schnell wie möglich nach der Tumorexzision und transportieren Sie die Probe in Quenc....

Diskussion

Die Entwirrung der heterogenen Zellpopulationen, die in der Mikroumgebung des Tumors vorhanden sind, ist ein aktives Schwerpunktgebiet der Krebsbiologie. In ähnlicher Weise existieren komplexe Gewebe bei gutartigen Pathologien wie Wundheilung und Fibrose. Die Multiom-Sequenzierung hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug entwickelt, das die Erfassung von gleichzelligen gepaarten scRNA- und ATAC-seq-Daten ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Zellkernen, die bei der Verarbeitung frischer, zerbrec.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113