Aislamiento optimizado de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos frescos y congelados para la secuenciación multioma

Resumen

El protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics, que incluye recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.

Resumen

La secuenciación multioma, que proporciona ARN unicelular emparejado o de la misma célula, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa con datos de secuenciación (secuenciación ATAC), representa un gran avance en nuestra capacidad para discernir la heterogeneidad de las células tumorales, un enfoque principal de la investigación traslacional del cáncer en este momento. Sin embargo, la calidad de los datos de secuenciación adquiridos con esta modalidad avanzada depende en gran medida de la calidad del material de entrada.

Las condiciones de digestión deben optimizarse para maximizar el rendimiento celular sin sacrificar la calidad. Esto es particularmente difícil en el contexto de tumores sólidos con matrices desmoplásicas densas que deben descomponerse suavemente para su liberación celular. Las células recién aisladas del tejido tumoral sólido son más frágiles que las aisladas de líneas celulares. Además, dado que los tipos celulares aislados son heterogéneos, se deben seleccionar las condiciones para soportar la población celular total.

Por último, las condiciones de aislamiento nuclear deben optimizarse en función de estas cualidades en términos de tiempos de lisis y tipos/ratios de reactivos. En este artículo, describimos nuestra experiencia con el aislamiento nuclear para la plataforma de secuenciación multioma 10x Genomics a partir de muestras de tumores sólidos. Proporcionamos recomendaciones para la digestión de tejidos, el almacenamiento de suspensiones unicelulares (si se desea) y el aislamiento y evaluación nuclear.

Introducción

A medida que aumenta nuestro conocimiento de la biología tumoral, también ha aumentado la importancia de analizar células heterogéneas en el microambiente tumoral ^1,2. La capacidad de adquirir ARN unicelular y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa con datos de secuenciación (secuenciación ATAC) de la misma célula en forma de célula emparejada (secuenciación multioma) proporciona un avance significativo hacia este fin ^3,4. Sin embargo, estos experimentos son costosos y requieren mucho tiempo, y la calidad y el impacto de los datos adquiridos....

Protocolo

Las muestras de cáncer de páncreas humano (adenocarcinoma ductal de páncreas) se adquirieron de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB en nuestro laboratorio. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes para la recolección de tejidos. El tejido se transportó desde el quirófano hasta el laboratorio y luego se procesó de la siguiente manera.

1. Disociación tisular (digestión)

1. Prepare el tampón de resumen (consulte la tabla de materiales).
2. Obtener el tejido de interés tan pronto como sea posible después de la escisión del tumor y transportar la muestra en tampón de enfriami....

Discusión

Desenredar las poblaciones celulares heterogéneas presentes en el microambiente tumoral es un área de enfoque activo en la biología del cáncer. Del mismo modo, existen tejidos complejos en patologías benignas como la cicatrización de heridas y la fibrosis. La secuenciación multioma se ha convertido en una poderosa herramienta que permite la adquisición de datos de secuenciación de ARNc y ATAC emparejados en la misma célula. Este protocolo describe el aislamiento de núcleos, lo que exige optimización en el ent.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113