Aislamiento optimizado de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos frescos y congelados para la secuenciación multioma

Resumen

El protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics, que incluye recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.

Resumen

La secuenciación multioma, que proporciona ARN unicelular emparejado o de la misma célula, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa con datos de secuenciación (secuenciación ATAC), representa un gran avance en nuestra capacidad para discernir la heterogeneidad de las células tumorales, un enfoque principal de la investigación traslacional del cáncer en este momento. Sin embargo, la calidad de los datos de secuenciación adquiridos con esta modalidad avanzada depende en gran medida de la calidad del material de entrada.

Las condiciones de digestión deben optimizarse para maximizar el rendimiento celular sin sacrificar la calidad. Esto es particularmente difícil en el contexto de tumores sólidos con matrices desmoplásicas densas que deben descomponerse suavemente para su liberación celular. Las células recién aisladas del tejido tumoral sólido son más frágiles que las aisladas de líneas celulares. Además, dado que los tipos celulares aislados son heterogéneos, se deben seleccionar las condiciones para soportar la población celular total.

Por último, las condiciones de aislamiento nuclear deben optimizarse en función de estas cualidades en términos de tiempos de lisis y tipos/ratios de reactivos. En este artículo, describimos nuestra experiencia con el aislamiento nuclear para la plataforma de secuenciación multioma 10x Genomics a partir de muestras de tumores sólidos. Proporcionamos recomendaciones para la digestión de tejidos, el almacenamiento de suspensiones unicelulares (si se desea) y el aislamiento y evaluación nuclear.

Introducción

A medida que aumenta nuestro conocimiento de la biología tumoral, también ha aumentado la importancia de analizar células heterogéneas en el microambiente tumoral ^1,2. La capacidad de adquirir ARN unicelular y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa con datos de secuenciación (secuenciación ATAC) de la misma célula en forma de célula emparejada (secuenciación multioma) proporciona un avance significativo hacia este fin ^3,4. Sin embargo, estos experimentos son costosos y requieren mucho tiempo, y la calidad y el impacto de los datos adquiridos dependen en gran medida de la calidad de las condiciones experimentales y los materiales. Se han publicado protocolos estandarizados para el aislamiento de núcleos ^5,6. Los tejidos frescos y heterogéneos requieren la optimización del protocolo, ya que las células recién aisladas de muestras tumorales sólidas son más frágiles que las aisladas de líneas celulares.

Otra consideración es que para los tumores sólidos, las muestras quirúrgicas a menudo no están disponibles en el quirófano hasta el final del día. Como tal, generalmente no es factible proceder directamente de la adquisición de la muestra a la captura de núcleos sin un paso de criopreservación. En nuestra experiencia, la congelación de una suspensión unicelular produce núcleos de la más alta calidad (en lugar de tejido entero ultracongelado u otras modalidades de conservación). Esto es particularmente cierto para los tipos de tejido enzimático con alto contenido de RNasa, como el páncreas.

Las condiciones de digestión de los tejidos también deben diseñarse para maximizar el rendimiento celular sin sacrificar la calidad⁷. En el contexto de los tipos de tumores sólidos con matrices desmoplásicas densas⁸, la matriz extracelular debe descomponerse suavemente para su liberación celular. Además, debido a que los tipos de células aisladas son heterogéneas, las condiciones deben ajustarse para soportar la población total de células. En el protocolo descrito se utilizan muestras de cáncer de páncreas humano (adenocarcinoma ductal de páncreas). El cáncer de páncreas representa un tipo de tumor altamente desmoplásico, que presagia tejidos y células relativamente pegajosos. Además, dado que los especímenes de tumores pancreáticos disponibles para la investigación también tienden a ser relativamente pequeños, se realizan esfuerzos para maximizar la cantidad de células capturadas.

El aislamiento de núcleos requiere la mayor optimización en términos de condiciones y tiempos de lisis celular, así como de tipos y proporciones de reactivos. La manipulación de los núcleos durante el aislamiento también requiere mucho cuidado. En este artículo, describimos nuestra experiencia en la optimización del aislamiento nuclear para la plataforma de secuenciación multioma 10x Genomics a partir de tejido tumoral sólido (Figura 1). Proporcionamos recomendaciones para la digestión de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares (si se desea) y el aislamiento nuclear.

Protocolo

Las muestras de cáncer de páncreas humano (adenocarcinoma ductal de páncreas) se adquirieron de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB en nuestro laboratorio. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes para la recolección de tejidos. El tejido se transportó desde el quirófano hasta el laboratorio y luego se procesó de la siguiente manera.

1. Disociación tisular (digestión)

1. Prepare el tampón de resumen (consulte la tabla de materiales).
2. Obtener el tejido de interés tan pronto como sea posible después de la escisión del tumor y transportar la muestra en tampón de enfriamiento (DMEM F-12 con ~5% de suero fetal bovino) o 1x PBS en hielo.
3. Picar el tejido con pinzas y tijeras limpias en 3-5 ml de tampón digestivo en una placa de Petri de 90 mm (Figura 2A).
4. Transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 50 ml y disocie en ~ 10 ml de tampón digestivo durante 30 min a 37 ° C usando un baño de agua con función de agitación o un agitador seco.
5. Retirar del agitador y enfriar con ~20 mL de medio de enfriamiento. Filtre la solución a través de un filtro de células de 100 μm en un tubo cónico limpio.
6. Recoja el tejido sólido restante del colador (vuelva a picar los trozos de tejido restantes si es necesario) y colóquelo en ~ 10 ml de tampón de digestión fresco durante otros 30 minutos a 37 ° C con agitación. Repita hasta que todo el tejido tumoral se haya disociado.
7. La suspensión de la célula de la piscina se alícuota y se filtra a través de un filtro de células de 70 μm seguido de un filtro de células de 40 μm en un tubo cónico limpio sobre hielo.
8. Centrifugar a las células de pellets a 500 × g durante 5 min a 4 °C y luego decantar el sobrenadante.

2. Criopreservación

1. Enjuague las células resuspendiendo el gránulo en 1 ml de 1x PBS.
2. Transfiera la suspensión celular (~ 1-10 millones de células / tubo para una congelación óptima) a un criovial de 1,5 ml en hielo.
3. Centrifugar a las células de pellets a 500 × g durante 5 min a 4 °C y luego decantar el sobrenadante.
4. Vuelva a suspender las células en 1 mL de solución Bambanker, transfiéralas a un criovial de 1,5 o 2 mL (Figura 2B) y congele utilizando un recipiente de congelación con una velocidad de enfriamiento de -1 °C/min (que contenga alcohol isopropílico al 100 %) a -80 °C, o transfiéralas a nitrógeno líquido si se prevé un almacenamiento a largo plazo de la muestra.

3. Aislamiento de núcleos

1. Descongele rápidamente el criovial de la suspensión celular y colóquelo sobre hielo húmedo.
2. Transfiera la suspensión celular descongelada a un tubo de microcentrífuga de 2 ml y rellene el vial a una solución de 2 ml con 1x PBS para enjuagar las células.
3. Obtener un recuento manual de células utilizando un hemocitómetro para evaluar tanto la cantidad como la calidad de las células (Figura 2C).
4. Centrifugar a las células de gránulos a 500 × g durante 5 min a 4 °C y, a continuación, decantar suavemente el sobrenadante utilizando puntas de pipeta progresivamente más pequeñas para dejar un gránulo seco y mantenerlo en hielo.
   1. Utilice un rotor de cubeta oscilante para todos los pasos de centrifugación. Para obtener el máximo rendimiento celular, coloque los tubos en la centrífuga con la bisagra hacia afuera y luego decante con la punta de la pipeta dirigida hacia el lado opuesto del tubo (Figura 2D).
      NOTA: Para decantar el sobrenadante, utilice puntas de pipeta progresivamente más pequeñas para eliminar el líquido y limitar la interrupción del gránulo y maximizar el volumen de líquido decantado. Esta estrategia es particularmente útil más adelante en el protocolo después de la extracción de núcleos, ya que la bolita de núcleos generalmente no es visible.
5. Prepare 1x tampón de lisis celular, tampón de dilución de lisis celular y tampón de lavado (Figura 3A) de acuerdo con el protocolo publicado con las siguientes modificaciones (consulte la Tabla 1, Tabla de materiales):
   NOTA: Coloque la digitonina en un bloque calefactor a 65 °C antes de usarla para disolver el precipitado (Figura 3B). Esto suele tardar unos 10 minutos.
6. Prepare el tampón de lisis celular 0,1x combinando 100 μl de tampón de lisis celular 1x y 900 μl de tampón de dilución de lisis celular, pipetee suavemente para mezclar y colóquelo en hielo.
7. Vuelva a suspender el gránulo celular en 100 μL de tampón de lisis celular 0,1x refrigerado y pipetee suavemente para mezclar 5x.
8. Incubar en hielo durante 3 minutos (Figura 3C).
9. Agregue 1 ml de tampón de lavado frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar suavemente 5 veces.
10. Centrifugar para granular los núcleos a 500 × g durante 5 min a 4 °C, decantar suavemente el sobrenadante a un gránulo seco y mantener en hielo.
    NOTA: Si el número de células iniciales es bajo (100.000-200.000 células), realice los pasos de lisis celular y lavado en un tubo de PCR de 200 μL en lugar de un tubo de microcentrífuga de 2 ml para disminuir el área de superficie del tubo y minimizar las pérdidas. En este caso, ajuste el volumen del tampón de lavado hacia abajo para acomodar el volumen del tubo más pequeño.
11. Repita los pasos 3.9-3.10 2 veces para un total de tres lavados.
12. Cuente manualmente los núcleos usando un portaobjetos de hemocitómetro bajo el microscopio. Use tinte azul de tripano si lo desea para proporcionar contraste para ver los núcleos y para ayudar a discernir los núcleos de las células no lisadas.
13. Prepare el tampón de 1x núcleos según el protocolo publicado: 20 existencias de tampón de núcleos, 1 mM de TDT, 1 U/μL de inhibidor de ARNasa en agua libre de nucleasas y manténgalo en hielo (consulte la Tabla de materiales).
14. Vuelva a suspender el gránulo de núcleos en 1x Nuclei Buffer en función de la recuperación de núcleos objetivo objetivo.
    NOTA: Si la concentración es lo suficientemente alta, apunte a una recuperación objetivo de 10.000 o ligeramente superior en este paso (3.230-8.060 núcleos/μL) al determinar el volumen de resuspensión inicial, dada la pérdida de volumen prevista de 25 μL y la disminución del 20% en la concentración con el filtrado (Paso 3.15).
15. Pase suavemente el volumen de los núcleos resuspendidos a través de un filtro de células con punta de pipeta de 40 μm y coloque los núcleos en hielo (Figura 3D).
16. Vuelva a contar los núcleos (Figura 4A-C). Diluya aún más la solución final con Nuclei Buffer si es necesario.
17. Transporta los núcleos en hielo y procede inmediatamente a la captura de núcleos según los protocolos publicados.

Resultados

Para aislar núcleos de alta calidad de muestras tumorales sólidas de pacientes para la secuenciación multioma (Figura 1), se disoció el tejido tumoral y se criopreservaba una suspensión unicelular (Figura 2A-D). A continuación, la suspensión celular se descongeló en el momento de la captura planificada del multioma. La captura de núcleos se llevó a cabo con reactivos tampón de lisis optimizados y sincronización para ...

Discusión

Desenredar las poblaciones celulares heterogéneas presentes en el microambiente tumoral es un área de enfoque activo en la biología del cáncer. Del mismo modo, existen tejidos complejos en patologías benignas como la cicatrización de heridas y la fibrosis. La secuenciación multioma se ha convertido en una poderosa herramienta que permite la adquisición de datos de secuenciación de ARNc y ATAC emparejados en la misma célula. Este protocolo describe el aislamiento de núcleos, lo que exige optimización en el ent...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113