Оптимизированное выделение ядер из свежих и замороженных образцов твердых опухолей для секвенирования мультиома

Резюме

Протокол обеспечивает надежный и оптимизированный подход к выделению ядер из солидных образцов опухолей для мультиомного секвенирования с использованием платформы 10x Genomics, включая рекомендации по условиям диссоциации тканей, криоконсервации одноклеточных суспензий и оценке изолированных ядер.

Аннотация

Мультиомное секвенирование, которое обеспечивает одноклеточные/парные одноклеточные РНК и анализ на доступный транспозазе хроматин с данными секвенирования (ATAC-секвенирование), представляет собой прорыв в нашей способности различать гетерогенность опухолевых клеток, что является основным направлением трансляционных исследований рака в настоящее время. Однако качество данных секвенирования, полученных с помощью этого усовершенствованного метода, сильно зависит от качества входного материала.

Условия пищеварения должны быть оптимизированы, чтобы максимизировать выход клеток без ущерба для качества. Это особенно сложно в контексте солидных опухолей с плотными десмопластическими матрицами, которые должны быть аккуратно разрушены для высвобождения клеток. Свежевыделенные клетки из солидной опухолевой ткани более хрупкие, чем клетки, выделенные из клеточных линий. Кроме того, поскольку выделенные типы клеток неоднородны, следует выбирать условия, поддерживающие общую клеточную популяцию.

Наконец, на основе этих качеств необходимо оптимизировать условия ядерной изоляции с точки зрения времени лизиса и типов/соотношений реагентов. В этой статье мы опишем наш опыт ядерной изоляции для платформы секвенирования мультиома 10x Genomics из солидных образцов опухолей. Мы даем рекомендации по расщеплению тканей, хранению одноклеточных суспензий (при желании), а также по выделению и оценке ядер.

Введение

По мере того, как наши знания о биологии опухолей растут, важность анализа гетерогенных клеток в микроокружении опухоли также возрастает ^1,2. Возможность получения одноклеточной РНК и анализа транспозазного хроматина с данными секвенирования (ATAC-секвенирование) из одной и той же клетки в парном клеточном режиме (мультиомное секвенирование) обеспечивает значительный прогресс в достижении этой цели ^3,4. Однако эти эксперименты являются дорогостоящими и трудоемкими, а качество и влияние полученных данных в значительной степени зависят от качества экспериментальных условий и материалов. Опубликованы стандартизированные протоколы выделения ядер ^5,6. Свежие и гетерогенные ткани требуют оптимизации протокола, поскольку свежевыделенные клетки из солидных образцов опухолей более хрупкие, чем клетки, выделенные из клеточных линий.

Еще одно соображение заключается в том, что при солидных опухолях хирургические образцы часто недоступны в операционной до позднего вечера. Таким образом, как правило, невозможно перейти непосредственно от отбора пробы к захвату ядер без этапа криоконсервации. По нашему опыту, замораживание одноклеточной суспензии дает ядра самого высокого качества (в отличие от мгновенной заморозки цельной ткани или других способов консервации). Это особенно верно для ферментативных типов тканей с высоким содержанием РНКазы, таких как поджелудочная железа.

Условия переваривания тканей также должны быть спроектированы таким образом, чтобы максимизировать выход клеток без ущерба для качества⁷. В контексте солидных опухолей с плотными десмопластическими матрицами⁸ внеклеточный матрикс должен быть аккуратно разрушен для высвобождения клеток. Кроме того, поскольку выделенные типы клеток неоднородны, условия должны быть скорректированы для поддержания общей популяции клеток. В описанном протоколе используются образцы рака поджелудочной железы человека (протоковая аденокарцинома поджелудочной железы). Рак поджелудочной железы представляет собой высокодесмопластический тип опухоли, который предвещает относительно липкую ткань и клетки. Более того, поскольку образцы опухолей поджелудочной железы, доступные для исследования, также имеют тенденцию быть относительно небольшими, предпринимаются усилия для максимального увеличения количества захваченных клеток.

Выделение ядер требует максимальной оптимизации с точки зрения условий и времени лизиса клеток, а также типов и соотношений реагентов. Обращение с ядрами в процессе изоляции также требует большой осторожности. В этой статье мы опишем наш опыт оптимизации ядерной изоляции для платформы 10-кратного секвенирования Genomics multiome из солидной опухолевой ткани (рис. 1). Мы даем рекомендации по расщеплению тканей, криоконсервации одноклеточных суспензий (при желании) и ядерной изоляции.

протокол

Образцы рака поджелудочной железы человека (протоковая аденокарцинома поджелудочной железы) были получены в нашей лаборатории в соответствии с протоколом, одобренным IRB. От пациентов было получено информированное согласие на забор тканей. Ткань транспортировалась из операционной в лабораторию, а затем обрабатывалась следующим образом.

1. Диссоциация тканей (пищеварение)

1. Подготовьте буфер дайджеста (см. Таблицу материалов).
2. Получить интересующую ткань как можно скорее после иссечения опухоли и транспортировать образец в буфере для закалки (DMEM F-12 с ~5% фетальной бычьей сыворотки) или 1x PBS на льду.
3. Измельчите ткань с помощью чистых щипцов и ножниц в 3-5 мл Digest Buffer в чашке Петри диаметром 90 мм (Рисунок 2A).
4. Переложите измельченную ткань в коническую пробирку объемом 50 мл и диссоциируйте в ~10 мл пищеварительного буфера в течение 30 минут при 37 °C, используя водяную баню с функцией встряхивания или сухую мешалку.
5. Выньте из мешалки и заглушите ~20 мл закалочной среды. Процедите раствор через ситечко с ячейками 100 мкм в чистую коническую пробирку.
6. Соберите оставшуюся твердую ткань из ситечка (при необходимости повторно измельчите оставшиеся кусочки ткани) и поместите в ~10 мл свежего буфера для переваривания еще на 30 минут при температуре 37 °C при перемешивании. Повторяйте до тех пор, пока вся опухолевая ткань не будет диссоциирована.
7. Суспензию ячейки пула аликвотируют и фильтруют через 70 мкм, а затем через сетчатое ситечко 40 мкм в чистую коническую трубку на льду.
8. Центрифугу для гранулированных ячеек при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, а затем сцеживают надосадочную жидкость.

2. Криоконсервация

1. Промойте клетки, повторно суспендировав гранулы в 1 мл 1x PBS.
2. Перенесите клеточную суспензию (~1-10 миллионов клеток/пробирка для оптимального замораживания) в криовиальную камеру объемом 1,5 мл на льду.
3. Центрифугу для гранулированных ячеек при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, а затем сцеживают надосадочную жидкость.
4. Ресуспендант клеток в 1 мл раствора Bambanker, переложить в криовиальную камеру объемом 1,5 или 2 мл (рис. 2B) и заморозить в морозильном контейнере со скоростью охлаждения -1 °C/мин (содержащем 100% изопропиловый спирт) при -80 °C, или перенести в жидкий азот, если предполагается более длительное хранение образца.

3. Выделение ядер

1. Быстро разморозьте криовиальную клеточную суспензию и поместите ее на влажный лед.
2. Перелейте размороженную клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и долейте флакон до 2 мл раствора 1x PBS для промывки клеток.
3. Получите ручной подсчет клеток с помощью гемоцитометра, чтобы оценить как количество, так и качество клеток (рис. 2C).
4. Центрифугу в грануляторах при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, а затем осторожно сцеживают надосадочную жидкость с помощью постепенно уменьшающихся наконечников пипетки, чтобы оставить сухие гранулы и держать их на льду.
   1. Используйте ротор с поворотным ковшом для всех этапов центрифугирования. Для максимального выхода клеток поместите пробирки в центрифугу шарниром наружу, а затем сцедите наконечник пипетки, направленный на противоположную сторону пробирки (рис. 2D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для декантации надосадочной жидкости используйте постепенно уменьшающиеся наконечники пипетки для удаления жидкости, чтобы ограничить разрушение гранул и при этом максимизировать объем сцеживаемой жидкости. Эта стратегия особенно полезна на более поздних этапах протокола после экстракции ядер, поскольку гранула ядра, как правило, не видна.
5. Приготовьте 1x буфер для лизиса клеток, буфер для разбавления лизиса клеток и буфер для промывки (рисунок 3A) в соответствии с опубликованным протоколом со следующими изменениями (см. таблицу 1, таблицу материалов):
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием поместите Digitonin на нагревательный блок при температуре 65 °C, чтобы растворить осадок (Рисунок 3B). Обычно это занимает около 10 минут.
6. Приготовьте буфер для лизиса клеток 0,1x, смешав 100 мкл 1x буфера для лизиса клеток и 900 мкл буфера для разбавления лизиса клеток, осторожно перемешайте пипетку и поместите на лед.
7. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл охлажденного 0,1-кратного буфера для лизиса клеток и осторожно перемешайте 5 раз.
8. Инкубируйте на льду в течение 3 мин (рисунок 3C).
9. Добавьте 1 мл охлажденного буфера для промывки и пипетку вверх и вниз, чтобы аккуратно перемешать 5 раз.
10. Центрифугу гранулировать ядра при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, осторожно сцедить надосадочную жидкость в сухую гранулу и выдержать на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если исходное количество клеток низкое (100 000-200 000 клеток), выполните этапы лизиса и промывки клеток в пробирке для ПЦР объемом 200 мкл вместо пробирки для микроцентрифуги объемом 2 мл, чтобы уменьшить площадь поверхности пробирки и минимизировать потери. В этом случае отрегулируйте громкость буфера промывки в меньшую сторону, чтобы вместить меньший объем трубки.
11. Повторите шаги 3.9-3.10 2 раза, чтобы в общей сложности сделать три стирки.
12. Вручную подсчитайте ядра с помощью предметного стекла гемоцитометра под микроскопом. При желании используйте трипановый синий краситель, чтобы обеспечить контраст для просмотра ядер и помочь отличить ядра от нелизированных клеток.
13. Приготовьте 1x Nuclei Buffer в соответствии с опубликованным протоколом: 20x Nuclei Buffer stock, 1 мМ DTT, 1 U/мкл ингибитора РНКазы в безнуклеазной воде и храните на льду (см. Таблицу материалов).
14. Ресуспендируйте гранулы ядер в 1x Nuclei Buffer в зависимости от целевого восстановления ядер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация достаточно высока, стремитесь к целевому извлечению 10 000 или немного выше на этом этапе (3 230-8 060 ядер/мкл) при определении начального объема ресуспендии, учитывая ожидаемую потерю объема на 25 мкл и снижение концентрации на 20% при фильтрации (шаг 3.15).
15. Осторожно пропустите ресуспендированный объем ядер через ситечко с наконечником пипетки 40 мкм и поместите ядра на лед (рис. 3D).
16. Пересчитайте ядра (рис. 4А-В). При необходимости разбавьте окончательный раствор буфером для ядер.
17. Транспортируйте ядра на льду и немедленно приступайте к захвату ядер в соответствии с опубликованными протоколами.

Результаты

Для выделения высококачественных ядер из образцов солидных опухолей пациента для мультиомного секвенирования (рис. 1) опухолевую ткань диссоциировали и криоконсервировали одноклеточную суспензию (рис. 2A-D). Затем клеточную суспензию р...

Обсуждение

Распутывание гетерогенных клеточных популяций, присутствующих в микроокружении опухоли, является активной областью внимания в биологии рака. Точно так же сложные ткани существуют при доброкачественных патологиях, таких как заживление ран и фиброз. Мультиомное секвенирование стало м...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113