Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

Riepilogo

Il protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multioma utilizzando la piattaforma 10x Genomics, comprese le raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione delle sospensioni a singola cellula e la valutazione dei nuclei isolati.

Abstract

Il sequenziamento multiomico, che fornisce RNA a singola cellula/appaiata e il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con dati di sequenziamento (sequenziamento ATAC), rappresenta una svolta nella nostra capacità di discernere l'eterogeneità delle cellule tumorali, un obiettivo primario della ricerca traslazionale sul cancro in questo momento. Tuttavia, la qualità dei dati di sequenziamento acquisiti utilizzando questa modalità avanzata dipende in larga misura dalla qualità del materiale in ingresso.

Le condizioni di digestione devono essere ottimizzate per massimizzare la resa cellulare senza sacrificare la qualità. Ciò è particolarmente impegnativo nel contesto di tumori solidi con matrici desmoplastiche dense che devono essere delicatamente scomposte per il rilascio cellulare. Le cellule appena isolate da tessuto tumorale solido sono più fragili di quelle isolate da linee cellulari. Inoltre, poiché i tipi di cellule isolate sono eterogenei, è necessario selezionare le condizioni per supportare la popolazione cellulare totale.

Infine, le condizioni di isolamento nucleare devono essere ottimizzate in base a queste qualità in termini di tempi di lisi e tipi/rapporti di reagenti. In questo articolo, descriviamo la nostra esperienza con l'isolamento nucleare per la piattaforma di sequenziamento multioma 10x Genomics da campioni di tumore solido. Forniamo raccomandazioni per la digestione tissutale, la conservazione di sospensioni unicellulari (se lo si desidera) e l'isolamento e la valutazione nucleare.

Introduzione

Con l'aumento della nostra conoscenza della biologia dei tumori, è aumentata anche l'importanza di analizzare cellule eterogenee nel microambiente tumorale ^1,2. La capacità di acquisire RNA a singola cellula e il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con dati di sequenziamento (sequenziamento ATAC) dalla stessa cellula in modo accoppiato (sequenziamento multiomico) fornisce un progresso significativo verso questo obiettivo ^3,4. Tuttavia, questi esperimenti sono costosi e richiedono molto tempo e la qualità e l'impatto dei dati acquisiti dipendono fortemente dalla qualità delle condizioni sperimentali e dei materiali. Sono stati pubblicati protocolli standardizzati per l'isolamento dei nuclei ^5,6. I tessuti freschi ed eterogenei richiedono l'ottimizzazione del protocollo poiché le cellule appena isolate da campioni tumorali solidi sono più fragili di quelle isolate da linee cellulari.

Un'altra considerazione è che per i tumori solidi, i campioni chirurgici spesso non sono disponibili dalla sala operatoria fino a tarda ora. Pertanto, non è generalmente possibile procedere direttamente dall'acquisizione del campione alla cattura dei nuclei senza una fase di crioconservazione. Nella nostra esperienza, il congelamento di una sospensione unicellulare produce nuclei di altissima qualità (piuttosto che l'intero tessuto congelato o altre modalità di conservazione). Ciò è particolarmente vero per i tipi di tessuto enzimatico ad alto contenuto di RNasi come il pancreas.

Anche le condizioni di digestione dei tessuti devono essere progettate per massimizzare la resa cellulare senza sacrificare la qualità⁷. Nel contesto dei tipi di tumore solido con matrici desmoplastiche dense⁸, la matrice extracellulare deve essere delicatamente scomposta per il rilascio cellulare. Inoltre, poiché i tipi di cellule isolate sono eterogenei, le condizioni devono essere adattate per supportare la popolazione cellulare totale. Nel protocollo descritto vengono utilizzati campioni di carcinoma pancreatico umano (adenocarcinoma duttale pancreatico). Il cancro del pancreas rappresenta un tipo di tumore altamente desmoplastico, che fa presagire tessuti e cellule relativamente appiccicosi. Inoltre, poiché anche i campioni di tumore pancreatico disponibili per la ricerca tendono ad essere relativamente piccoli, vengono fatti sforzi per massimizzare la quantità di cellule catturate.

L'isolamento dei nuclei richiede la massima ottimizzazione in termini di condizioni e tempi di lisi cellulare, nonché di tipi e rapporti di reagenti. Anche la manipolazione dei nuclei nel corso dell'isolamento richiede grande attenzione. In questo articolo, descriviamo la nostra esperienza nell'ottimizzazione dell'isolamento nucleare per la piattaforma di sequenziamento multioma 10x Genomics da tessuto tumorale solido (Figura 1). Forniamo raccomandazioni per la digestione tissutale, la crioconservazione di sospensioni unicellulari (se lo si desidera) e l'isolamento nucleare.

Protocollo

I campioni di carcinoma pancreatico umano (adenocarcinoma duttale pancreatico) sono stati acquisiti secondo un protocollo approvato dall'IRB nel nostro laboratorio. È stato ottenuto il consenso informato dei pazienti per la raccolta dei tessuti. Il tessuto è stato trasportato dalla sala operatoria al laboratorio e poi processato come segue.

1. Dissociazione tissutale (digestione)

1. Preparare il tampone digestato (vedere la tabella dei materiali).
2. Ottenere il tessuto di interesse il prima possibile dopo l'escissione del tumore e trasportare il campione in tampone di tempra (DMEM F-12 con ~5% di siero fetale bovino) o 1x PBS su ghiaccio.
3. Tritare il tessuto utilizzando pinze e forbici pulite in 3-5 ml di tampone digestato in una capsula di Petri da 90 mm (Figura 2A).
4. Trasferire il tessuto tritato in una provetta conica da 50 mL e dissociarlo in ~10 mL di tampone digestato per 30 minuti a 37 °C utilizzando un bagno d'acqua con funzione di agitazione o un agitatore a secco.
5. Rimuovere dall'agitatore e spegnere con ~20 mL di mezzo di tempra. Filtrare la soluzione attraverso un colino cellulare da 100 μm in una provetta conica pulita.
6. Raccogliere il tessuto solido rimanente dal colino (tritare nuovamente i pezzi di tessuto rimanenti se necessario) e metterlo in ~10 mL di tampone digestato fresco per altri 30 minuti a 37 °C con agitazione. Ripetere fino a quando tutto il tessuto tumorale non è stato dissociato.
7. La sospensione della cella del pool aliquota e filtra attraverso un filtro cellulare da 70 μm seguito da un filtro cellulare da 40 μm in un tubo conico pulito su ghiaccio.
8. Centrifugare in celle di pellet a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e poi travasare il surnatante.

2. Crioconservazione

1. Sciacquare le cellule risospendendo il pellet in 1 mL di 1x PBS.
2. Trasferire la sospensione cellulare (~1-10 milioni di cellule/provetta per un congelamento ottimale) in un crioviale da 1,5 mL su ghiaccio.
3. Centrifugare in celle di pellet a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e poi travasare il surnatante.
4. Risospendere le cellule in 1 mL di soluzione di Bambanker, trasferirle in un crioviale da 1,5 o 2 mL (Figura 2B) e congelarle utilizzando un contenitore di congelamento a velocità di raffreddamento di -1 °C/min (contenente alcol isopropilico al 100%) a -80 °C, oppure trasferire in azoto liquido se si prevede una conservazione a lungo termine del campione.

3. Isolamento dei nuclei

1. Scongelare rapidamente il crioviale della sospensione cellulare e posizionarlo su ghiaccio bagnato.
2. Trasferire la sospensione cellulare scongelata in una provetta per microcentrifuga da 2 mL e rabboccare il flaconcino con una soluzione da 2 mL con 1x PBS per risciacquare le cellule.
3. Ottenere un conteggio manuale delle cellule utilizzando un emocitometro per valutare sia la quantità che la qualità delle cellule (Figura 2C).
4. Centrifugare in celle di pellet a 500 × g per 5 minuti a 4 °C e poi decantare delicatamente il surnatante utilizzando puntali di pipette progressivamente più piccoli per lasciare un pellet asciutto e mantenerlo sul ghiaccio.
   1. Utilizzare un rotore a benna oscillante per tutte le fasi di centrifugazione. Per ottenere la massima resa cellulare, posizionare le provette nella centrifuga con la cerniera rivolta verso l'esterno, quindi decantare con la punta della pipetta rivolta verso il lato opposto della provetta (Figura 2D).
      NOTA: Per decantare il surnatante, utilizzare puntali per pipette progressivamente più piccoli per rimuovere il fluido per limitare l'interruzione del pellet massimizzando al contempo il volume del fluido decantato. Questa strategia è particolarmente utile più avanti nel protocollo successivo all'estrazione dei nuclei, poiché il pellet di nuclei non è generalmente visibile.
5. Preparare 1x Cell Lysis Buffer, Cell Lysis Dilution Buffer e Wash Buffer (Figura 3A) secondo il protocollo pubblicato con le seguenti modifiche (vedere Tabella 1, Tabella dei materiali):
   NOTA: Posizionare la Digitonin su un blocco riscaldante a 65 °C prima dell'uso per sciogliere il precipitato (Figura 3B). Questa operazione richiede in genere circa 10 minuti.
6. Preparare il tampone di lisi cellulare 0,1x combinando 100 μL di 1x tampone di lisi cellulare e 900 μL di tampone di diluizione per lisi cellulare, pipettare delicatamente per mescolare e metterlo sul ghiaccio.
7. Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di tampone di lisi cellulare 0,1x raffreddato e pipettare delicatamente per miscelare 5x.
8. Incubare su ghiaccio per 3 minuti (Figura 3C).
9. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio refrigerato e pipettare su e giù per mescolare delicatamente 5 volte.
10. Centrifugare per pellettare i nuclei a 500 × g per 5 minuti a 4 °C, travasare delicatamente il surnatante in un pellet secco e mantenere in ghiaccio.
    NOTA: Se il numero di cellule di partenza è basso (100.000-200.000 cellule), eseguire le fasi di lisi e lavaggio delle cellule in una provetta PCR da 200 μL anziché in una provetta da microcentrifuga da 2 mL per ridurre la superficie della provetta e ridurre al minimo le perdite. In questo caso, regolare il volume del tampone di lavaggio verso il basso per adattarlo al volume del tubo più piccolo.
11. Ripetere i passaggi 3.9-3.10 2 volte per un totale di tre lavaggi.
12. Contare manualmente i nuclei utilizzando un vetrino emocitometrico al microscopio. Se lo si desidera, utilizzare un colorante blu tripano per fornire contrasto per la visualizzazione dei nuclei e per aiutare a distinguere i nuclei dalle cellule non lisate.
13. Preparare 1x Nuclei Buffer secondo il protocollo pubblicato: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor in acqua priva di nucleasi e tenere in ghiaccio (vedere la tabella dei materiali).
14. Risospendere il pellet di nuclei in 1x Nuclei Buffer in base al recupero dei nuclei mirato.
    NOTA: Se la concentrazione è sufficientemente alta, puntare a un recupero mirato di 10.000 o leggermente superiore in questa fase (3.230-8.060 nuclei/μL) quando si determina il volume di risospensione iniziale, data la perdita di volume prevista di 25 μL e la diminuzione del 20% della concentrazione con il filtraggio (passaggio 3.15).
15. Far passare delicatamente il volume dei nuclei risospesi attraverso un filtro cellulare con punta per pipetta da 40 μm e posizionare i nuclei sul ghiaccio (Figura 3D).
16. Contate i nuclei (Figura 4A-C). Diluire ulteriormente la soluzione finale con Nuclei Buffer, se necessario.
17. Trasportare i nuclei sul ghiaccio e procedere immediatamente con la cattura dei nuclei secondo i protocolli pubblicati.

Risultati

Per isolare nuclei di alta qualità da campioni di tumori solidi di pazienti per il sequenziamento del multioma (Figura 1), il tessuto tumorale è stato dissociato e una sospensione a singola cellula è stata crioconservata (Figura 2A-D). La sospensione cellulare è stata poi scongelata al momento della cattura pianificata del multioma. La cattura dei nuclei è stata condotta con reagenti tampone di lisi ottimizzati e tempistich...

Discussione

Districare le popolazioni cellulari eterogenee presenti nel microambiente tumorale è un'area di interesse attiva nella biologia del cancro. Allo stesso modo, i tessuti complessi esistono in patologie benigne come la guarigione delle ferite e la fibrosi. Il sequenziamento multioma è emerso come un potente strumento che consente l'acquisizione di dati scRNA- e ATAC-seq accoppiati nella stessa cellula. Questo protocollo descrive l'isolamento dei nuclei, che richiede un'ottimizzazione nell'ambito dell'elaborazione di campi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113