בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

Summary

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

Abstract

ריצוף מולטיום, המספק RNA חד-תאי זהה/מזווג והבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing), מייצג פריצת דרך ביכולתנו להבחין בהטרוגניות של תאי הגידול - מוקד עיקרי של מחקר סרטן תרגומי בשלב זה. עם זאת, איכות נתוני הרצף הנרכשים באמצעות מודל מתקדם זה תלויה מאוד באיכות חומר הקלט.

תנאי העיכול צריכים להיות אופטימליים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב את האיכות. זה מאתגר במיוחד בהקשר של גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות שיש לפרק בעדינות לשחרור תאים. תאים שבודדו טריים מרקמת גידול מוצקה הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים. בנוסף, מכיוון שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש לבחור תנאים שיתמכו באוכלוסיית התאים הכוללת.

לבסוף, תנאי בידוד גרעיני חייבים להיות אופטימליים בהתבסס על תכונות אלה במונחים של זמני ליזה וסוגים/יחסים מגיבים. במאמר זה, אנו מתארים את הניסיון שלנו עם בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף 10x Genomics multiome מדגימות גידול מוצק. אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, אחסון של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים), בידוד גרעיני והערכה.

Introduction

ככל שהידע שלנו על ביולוגיה של הגידול גדל, החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים על פני מיקרו-סביבה של הגידול גדלה גם היא ^1,2. היכולת לרכוש RNA חד-תאי והבדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing) מאותו תא בצורה זוגית (ריצוף מולטיום) מספקת התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו ^3,4. עם זאת, ניסויים אלה יקרים וגוזלים זמן, ואיכות וההשפעה של הנתונים המתקבלים תלויים מאוד באיכות תנאי הניסוי והחומרים. פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד גרעינים פורסמו ^5,6. רקמות טריות והטרוגניות דורשות אופטימיזציה של פרוטוקול מכיוון שתאים שבודדו טריים מדגימות גידול מוצקות הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים.

שיקול נוסף הוא שעבור גידולים מוצקים, דגימות כירורגיות לרוב אינן זמינות מחדר הניתוח עד מאוחר ביום. ככזה, זה בדרך כלל לא ריאלי להמשיך ישירות מרכישת דגימה ללכידת גרעינים ללא שלב שימור בהקפאה. מניסיוננו, הקפאת תרחיף חד-תאי מניבה גרעינים באיכות הגבוהה ביותר (ולא רקמה שלמה קפואה בהבזק או שיטות שימור אחרות). זה נכון במיוחד עבור סוגי רקמות אנזימטיות עם תוכן RNase גבוה כגון הלבלב.

תנאי עיכול רקמות צריכים גם להיות מתוכננים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב איכות⁷. בהקשר של סוגי גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות⁸, יש לפרק בעדינות את המטריצה החוץ תאית לשחרור תאים. בנוסף, מאחר שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש להתאים את התנאים לתמיכה באוכלוסיית התאים הכוללת. דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) משמשות בפרוטוקול המתואר. סרטן הלבלב מייצג סוג גידול דסמופלסטי מאוד, אשר מבשר רקמות ותאים דביקים יחסית. יתר על כן, מכיוון שדגימות גידול הלבלב הזמינות למחקר נוטות להיות קטנות יחסית, נעשים מאמצים למקסם את כמות התאים שנלכדים.

בידוד גרעינים דורש את האופטימיזציה הרבה ביותר במונחים של תנאי ליזה התא ועיתוי, כמו גם סוגים ויחסים מגיבים. גם הטיפול בגרעינים במהלך הבידוד דורש זהירות רבה. במאמר זה אנו מתארים את הניסיון שלנו במיטוב בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף מולטי-ome 10x Genomics מרקמת גידול מוצקה (איור 1). אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים) ובידוד גרעיני.

Protocol

דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) נרכשו על פי פרוטוקול שאושר על ידי IRB במעבדה שלנו. התקבלה הסכמה מדעת של המטופלים לאיסוף רקמות. הרקמה הועברה מחדר הניתוח למעבדה ולאחר מכן טופלה באופן הבא.

1. דיסוציאציה רקמות (עיכול)

1. הכן את מאגר Digest (ראה טבלת חומרים).
2. השג את הרקמה המעניינת בהקדם האפשרי לאחר כריתת הגידול והעביר את הדגימה במאגר מרווה (DMEM F-12 עם ~ 5% נסיוב בקר עוברי) או 1x PBS על קרח.
3. טחנו את הרקמה באמצעות מלקחיים נקיים ומספריים ב-3-5 מ"ל של חיץ Digest בצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ (איור 2A).
4. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומנתקים ב~10 מ"ל של חיץ Digest למשך 30 דקות ב-37°C באמצעות אמבט מים עם פונקציית רעד או תסיסה יבשה.
5. הסר מן התסיסה להרוות עם ~ 20 מ"ל של מדיום מרווה. סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי.
6. אספו את כל הרקמה המוצקה שנותרה מהמסננת (טחנו מחדש את חתיכות הרקמה הנותרות במידת הצורך), והניחו ב~10 מ"ל של חיץ Digest טרי למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 37°C עם תסיסה. חזור על הפעולה עד שכל רקמת הגידול מנותקת.
7. תרחיף תאי הבריכה מתעלים ומסננים דרך 70 מיקרומטר ואחריו מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי על קרח.
8. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.

2. שימור בהקפאה

1. לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1 מ"ל של 1x PBS.
2. העבר את תרחיף התא (~ 1-10 מיליון תאים / צינור להקפאה אופטימלית) לקריביאל של 1.5 מ"ל על קרח.
3. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.
4. השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של תמיסת במבנקר, העבר לקריביאל של 1.5 או 2 מ"ל (איור 2B), והקפיא באמצעות מיכל הקפאה בקצב קירור של -1°C/min (המכיל 100% אלכוהול איזופרופיל) ב-80°C-, או העבירו לחנקן נוזלי אם צפוי אחסון ארוך טווח של הדגימה.

3. בידוד גרעינים

1. הפשירו במהירות את ההקפאה של תרחיף התאים והניחו אותו על קרח רטוב.
2. העבירו את מתלה התאים המופשר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ומלאו את הבקבוקון לתמיסת 2 מ"ל ב-1x PBS כדי לשטוף את התאים.
3. השיגו ספירת תאים ידנית באמצעות המוציטומטר כדי להעריך הן את כמות התאים והן את איכותם (איור 2C).
4. צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בעדינות decarant supernatant באמצעות קצות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להשאיר מאחור גלולה יבשה ולשמור אותו על קרח.
   1. השתמש ברוטור דלי נדנדה עבור כל שלבי הצנטריפוגה. לתפוקת תאים מרבית, הניחו את הצינורות בצנטריפוגה כשהציר פונה החוצה ולאחר מכן דקאנט כשקצה הפיפטה מכוון לצד הנגדי של הצינור (איור 2D).
      הערה: כדי לנטרל את הסופרנטנט, השתמש בקצוות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להסיר נוזל כדי להגביל את ההפרעה של הגלולה תוך הגדלת נפח הנוזל decanted. אסטרטגיה זו מועילה במיוחד בהמשך הפרוטוקול לאחר מיצוי גרעינים מכיוון שכדורית הגרעינים בדרך כלל אינה נראית לעין.
5. הכינו 1x מאגר ליזה של תאים, מאגר דילול ליזה של תאים ומאגר שטיפה (איור 3A) בהתאם לפרוטוקול שפורסם עם השינויים הבאים (ראו טבלה 1, טבלת חומרים):
   הערה: הניחו את הדיגיטונין על גוש חימום בטמפרטורה של 65°C לפני השימוש כדי להמיס את המשקע (איור 3B). פעולה זו נמשכת בדרך כלל כ-10 דקות.
6. הכינו את מאגר הליזה של התאים 0.1x על ידי שילוב של 100 μL של 1x Cell Lysis Buffer ו-900 μL של Cell Lysis Dilution Buffer, פיפטה עדינה לערבוב והניחו אותה על קרח.
7. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-100 μL של חיץ ליזיס תאי 0.1x מקורר ולערבב פיפטה עדינה פי 5.
8. דגרו על קרח במשך 3 דקות (איור 3C).
9. הוסיפו 1 מ"ל של Wash Buffer צונן ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות פי 5.
10. צנטריפוגה כדי להניע את הגרעינים ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, בעדינות decant supernatant לגלולה יבשה, ולשמור על קרח.
    הערה: אם מספר התא ההתחלתי נמוך (100,000-200,000 תאים), בצע את שלבי הליזה והשטיפה של התא בצינור PCR של 200 מיקרוליטר במקום בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל כדי להקטין את שטח הפנים של הצינור ולמזער הפסדים. במקרה זה, כוונן את עוצמת הקול של מאגר הכביסה כלפי מטה כדי להתאים לנפח הצינור הקטן יותר.
11. חזור על שלבים 3.9-3.10 2x עבור שלוש כביסות בסך הכל.
12. ספור ידנית את הגרעינים באמצעות שקופית המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ. השתמש בצבע כחול טריפאן אם תרצה כדי לספק ניגודיות לצפייה בגרעינים וכדי לעזור להבחין בין גרעינים לתאים שלא עברו ניתוח.
13. הכינו את מאגר הגרעינים 1x לפי הפרוטוקול שפורסם: מלאי מאגר גרעינים 20x, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor במים נטולי נוקלאז ושמרו על קרח (ראו טבלת חומרים).
14. השהה מחדש את כדורית הגרעינים במאגר גרעינים 1x בהתבסס על שחזור גרעינים ממוקד מטרה.
    הערה: אם הריכוז גבוה מספיק, יש לשאוף להתאוששות ממוקדת של 10,000 או מעט גבוה יותר בשלב זה (3,230-8,060 גרעינים/μL) בעת קביעת נפח התרחיף ההתחלתי, בהתחשב באובדן הנפח הצפוי של 25 μL והירידה של 20% בריכוז עם סינון (שלב 3.15).
15. העבירו בעדינות את נפח הגרעינים המרחפים מחדש דרך מסננת פיפטה של 40 מיקרומטר והניחו את הגרעינים על קרח (איור 3D).
16. ספרו מחדש את הגרעינים (איור 4A-C). דללו את הפתרון הסופי עוד יותר עם Nuclei Buffer במידת הצורך.
17. העבירו את הגרעינים על קרח והמשיכו מיד בלכידת גרעינים לפי פרוטוקולים שפורסמו.

תוצאות

כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה מדגימות של גידולים מוצקים של מטופלים לצורך ריצוף מולטיומי (איור 1), רקמת הגידול נותקה ותרחיף של תא בודד נשמר בהקפאה (איור 2A-D). לאחר מכן הופשר מתלה התא בזמן לכידת המולטיום המתוכננת. לכידת גרעינים בוצעה עם ריאגנ...

Discussion

התרת הסבך של אוכלוסיות התאים ההטרוגניות הקיימות במיקרו-סביבה של הגידול היא תחום פעיל של התמקדות בביולוגיה של סרטן. באופן דומה, רקמות מורכבות קיימות בפתולוגיות שפירות כגון ריפוי פצעים ופיברוזיס. ריצוף Multiome התגלה ככלי רב עוצמה המאפשר רכישה של נתוני scRNA ו- ATAC-seq מזווגים של תאים זהים. פרוטוקול ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113