Optimisation de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîches et congelées pour le séquençage multiome

Résumé

Le protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plate-forme 10x Genomics, y compris des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires et l’évaluation des noyaux isolés.

Résumé

Le séquençage multiome, qui fournit des données de séquençage (séquençage ATAC), qui fournit des données de séquençage de l’ARN unicellulaire identique ou apparié et le test de la chromatine accessible par transposase (séquençage ATAC), représente une percée dans notre capacité à discerner l’hétérogénéité des cellules tumorales, un objectif principal de la recherche translationnelle sur le cancer à l’heure actuelle. Cependant, la qualité des données de séquençage acquises à l’aide de cette modalité avancée dépend fortement de la qualité du matériau d’entrée.

Les conditions de digestion doivent être optimisées pour maximiser le rendement cellulaire sans sacrifier la qualité. Ceci est particulièrement difficile dans le contexte des tumeurs solides avec des matrices desmoplastiques denses qui doivent être décomposées doucement pour la libération cellulaire. Les cellules fraîchement isolées du tissu tumoral solide sont plus fragiles que celles isolées des lignées cellulaires. De plus, comme les types de cellules isolées sont hétérogènes, les conditions doivent être sélectionnées pour soutenir la population cellulaire totale.

Enfin, les conditions d’isolement nucléaire doivent être optimisées en fonction de ces qualités en termes de temps de lyse et de types/ratios de réactifs. Dans cet article, nous décrivons notre expérience de l’isolement nucléaire pour la plate-forme de séquençage multiome 10x Genomics à partir d’échantillons de tumeurs solides. Nous fournissons des recommandations pour la digestion des tissus, le stockage des suspensions unicellulaires (si désiré), ainsi que l’isolement et l’évaluation nucléaires.

Introduction

Au fur et à mesure que nos connaissances sur la biologie des tumeurs augmentent, l’importance de l’analyse des cellules hétérogènes dans le microenvironnement tumoral a également augmenté ^1,2. La possibilité d’acquérir de l’ARN unicellulaire et le dosage de la chromatine accessible par transposase avec des données de séquençage (séquençage ATAC) à partir de la même cellule à la manière d’une cellule appariée (séquençage multiome) constitue une avancée significative vers cette fin ^3,4. Cependant, ces expériences sont coûteuses et prennent beaucoup de te....

Protocole

Des échantillons de cancer du pancréas humain (adénocarcinome canalaire pancréatique) ont été prélevés dans notre laboratoire selon un protocole approuvé par l’IRB. Le consentement éclairé des patients a été obtenu pour le prélèvement de tissus. Les tissus ont été transportés de la salle d’opération au laboratoire, puis traités comme suit.

1. Dissociation tissulaire (digestion)

1. Préparez le tampon de synthèse (voir le tableau des matériaux).
2. Obtenir le tissu d’intérêt dès que possible après l’exérèse de la tumeur et transporter l’échantillon dans un tampon de trempe (DMEM F-12 avec ~5% de....

Discussion

Démêler les populations cellulaires hétérogènes présentes dans le microenvironnement tumoral est un domaine d’intérêt actif en biologie du cancer. De même, des tissus complexes existent dans les pathologies bénignes telles que la cicatrisation des plaies et la fibrose. Le séquençage multiome est apparu comme un outil puissant permettant l’acquisition de données de séquençage de l’ARNsc et de l’ATAC appariés de cellules identiques. Ce protocole décrit l’isolement des noyaux, ce qui exige une opt.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113