Multiome Sequencing을 위한 신선 및 냉동 고형 종양 검체에서 최적화된 핵 분리

요약

이 프로토콜은 조직 해리 조건, 단일 세포 현탁액의 동결 보존 및 분리된 핵 평가에 대한 권장 사항을 포함하여 10x Genomics 플랫폼을 사용하여 다중 종양 시퀀싱을 위해 고형 종양 검체에서 핵을 분리하는 데 신뢰할 수 있고 최적화된 접근 방식을 제공합니다.

초록

동일 세포/쌍을 이루는 단일 세포 RNA 및 염기서열분석(ATAC-sequencing) 데이터를 통해 transposase 접근 가능한 염색질에 대한 분석을 제공하는 Multiome 염기서열분석은 현재 중개암 연구의 주요 초점인 종양 세포 이질성을 식별하는 능력의 돌파구를 나타냅니다. 그러나 이 고급 양식을 사용하여 수집된 염기서열분석 데이터의 품질은 입력 자료의 품질에 크게 의존합니다.

품질 저하 없이 세포 수율을 극대화하기 위해 분해 조건을 최적화해야 합니다. 이는 세포 방출을 위해 부드럽게 분해되어야 하는 조밀한 탈형성 매트릭스가 있는 고형 종양의 맥락에서 특히 어렵습니다. 고형 종양 조직에서 갓 분리한 세포는 세포주에서 분리한 세포보다 더 취약합니다. 또한 분리된 세포 유형이 이질적이기 때문에 전체 세포 집단을 지원하기 위한 조건을 선택해야 합니다.

마지막으로, 핵 격리 조건은 용해 시간 및 시약 유형/비율 측면에서 이러한 특성을 기반으로 최적화되어야 합니다. 이 기사에서는 고형 종양 표본에서 10x Genomics 멀티오메 염기서열 분석 플랫폼에 대한 핵 분리에 대한 경험을 설명합니다. 당사는 조직 분해, 단세포 현탁액 보관(원하는 경우), 핵 분리 및 평가에 대한 권장 사항을 제공합니다.

서문

종양 생물학에 대한 지식이 증가함에 따라 종양 미세환경 전반에 걸쳐 이종 세포를 분석하는 것의 중요성도 증가했습니다 ^1,2. 단일 세포 RNA를 획득하고 쌍 세포 방식(멀티오메 시퀀싱)으로 동일한 세포에서 염기서열분석(ATAC-sequencing) 데이터를 사용하여 transposase-accessible chromatin에 대한 분석을 획득하는 능력은 이러한 목적을 향한 상당한 발전을 제공합니다 ^3,4. 그러나 이러한 실험은 비용과 시간이 많이 소요되며 수집된 데이터의 품질과 영향은 실험 조건 및 재료의 품질에 크게 좌우됩니다. 핵 분리를 위한 표준화된 프로토콜이 발표되었습니다 ^5,6. 신선하고 이질적인 조직은 고형 종양 검체에서 갓 분리한 세포가 세포주에서 분리한 세포보다 더 취약하기 때문에 프로토콜 최적화가 필요합니다.

또 다른 고려 사항은 고형 종양의 경우 수술실에서 늦은 시간까지 수술 표본을 구할 수 없는 경우가 많다는 것....

프로토콜

인간 췌장암(췌관 선암) 샘플은 우리 실험실에서 IRB 승인 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 조직 채취를 위해 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 조직을 수술실에서 실험실로 이송한 후 다음과 같이 처리하였다.

1. 조직 해리(소화)

1. 다이제스트 버퍼를 준비합니다( 재료 표 참조).
2. 종양 절제 후 가능한 한 빨리 관심 조직을 확보하고 검체를 담금질 완충액(~5% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM F-12) 또는 얼음 위의 1x PBS로 운반합니다.
3. 깨끗한 겸자와 가위를 사용하여 90mm 페트리 접시에 담긴 3-5mL의 분해 완충액에 조직을 다집니다(그림 2A).
4. 다진 조직을 50mL 원뿔형 튜브에 옮기고 진탕 기능이 있는 수조 또는 건식 교반기를 사용하여 37°C에서 30분 동안 ~10mL의 분해 완충액에서 해리합니다.
5. 교반기에서 제거하고 ~20mL의 담금질 배지로 담금질합니다. 100μm 셀 스트레이너를 통해 용액을 깨끗한 원뿔형 튜브로 여과합니다.
6. 스트레이너에서 남아 있는 고형 조직을 수집하고(필요한 경우 남은 조직 ....

토론

종양 미세환경에 존재하는 이질적인 세포 집단을 푸는 것은 암 생물학에서 활발하게 중점적으로 연구하는 분야입니다. 마찬가지로, 상처 치유 및 섬유증과 같은 양성 병리학에는 복잡한 조직이 존재합니다. 멀티오메 염기서열분석은 동일 세포 쌍을 이룬 scRNA 및 ATAC-seq 데이터를 획득할 수 있는 강력한 도구로 부상했습니다. 이 프로토콜은 신선하고 깨지기 쉬운 작은 종양 검체를 처리하는 환경에.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113