マルチオームシーケンシングのための新鮮および凍結固形腫瘍標本からの最適化された核分離(英語)

要約

このプロトコルは、10x Genomicsプラットフォームを使用したマルチオームシーケンシングのための固形腫瘍標本からの核の分離に信頼性が高く最適化されたアプローチを提供し、組織解離条件、単一細胞懸濁液の凍結保存、および単離された核の評価に関する推奨事項を含みます。

要約

マルチオームシーケンシングは、同一細胞/ペアのシングルセルRNAおよびトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイとシーケンシング(ATACシーケンシング)データを提供し、現時点でのトランスレーショナルがん研究の主な焦点である腫瘍細胞の不均一性を識別する能力のブレークスルーを表しています。しかし、この高度なモダリティを用いて得られたシーケンシングデータの品質は、インプット材料の品質に大きく依存します。

品質を犠牲にすることなく細胞収量を最大化するには、消化条件を最適化する必要があります。これは、細胞放出のために穏やかに分解する必要がある高密度の線維形成マトリックスを伴う固形腫瘍の状況で特に困難です。固形腫瘍組織から新たに単離された細胞は、細胞株から単離された細胞よりも脆弱です。さらに、単離された細胞タイプは不均一であるため、全細胞集団をサポートする条件を選択する必要があります。

最後に、核分離条件は、溶解時間と試薬の種類/比率の観点から、これらの品質に基づいて最適化する必要があります。本稿では、固形腫瘍標本からの10x Genomicsマルチオームシーケンシングプラットフォームの核分離に関する当社の経験について説明します。組織消化、単一細胞懸濁液の保管(必要な場合)、核の単離と評価に関する推奨事項を提供します。

概要

腫瘍生物学に関する知識が深まるにつれて、腫瘍微小環境全体で不均一な細胞を分析することの重要性も高まっています^1,2。シングルセルRNAと、同じ細胞からペアセル方式(マルチオームシーケンシング)でトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンとシーケンシング(ATACシーケンシング)データを取得する能力は、この目的に向けて大きな進歩をもたらします^3,4。しかし、これらの実験には費用と時間がかかり、得られたデータの品質と影響は、実験条件と材料の品質に大きく依存します。核単離のための標準化されたプロトコル^{が公開されています5,6}。固形腫瘍標本から新たに単離された細胞は、細胞株から単離された細胞よりも脆弱であるため、新鮮で不均一な組織にはプロトコルの最適化が必要です。

また、固形腫瘍の場合、手術標本が手術室から夜遅くまで手に入らないことが多いことも考慮する必要があります。そのため、凍結保存ステップなしでサンプル取得から核捕捉に直接進むことは一般的には不可能です。私たちの経験では、単一細胞懸濁液を凍結すると、(組織全体を瞬間凍結したり、他の保存....

プロトコル

ヒト膵臓癌(膵管腺癌)のサンプルは、IRBが承認したプロトコルに従って私たちの研究室で取得されました。組織採取について患者からインフォームドコンセントが得られました。組織は手術室から実験室に運ばれ、その後次のように処理されました。

1.組織の解離(消化)

1. ダイジェストバッファーを調製します( 材料表を参照)。
2. 腫瘍切除後、できるだけ早く目的の組織を採取し、検体をクエンチバッファー(~5%のウシ胎児血清を含むDMEM F-12)または氷上で1x PBSで輸送します。
3. 清潔な鉗子とハサミを使用して、90 mmのシャーレに3〜5 mLのダイジェストバッファーを入れて組織をみじん切りにします(図2A)。
4. ミンチにした組織を50 mLのコニカルチューブに移し、~10 mLのダイジェストバッファー中で、振とう機能付きウォーターバスまたはドライアジテーターを使用して37°Cで30分間解離します。
5. 攪拌機から取り出し、~20 mLの急冷培地で急冷します。溶液を100 μmのセルストレーナーで濾過し、清潔なコニカルチューブに入れます。
6. ストレーナーから残りの固形組織を回収し(必要に応じて残りの組織片を再ミンチします)、~10 mLの新鮮なダイジェスト....

ディスカッション

腫瘍微小環境に存在する不均一な細胞集団を解きほぐすことは、がん生物学における活発な焦点分野です。同様に、創傷治癒や線維症などの良性の病状には複雑な組織が存在します。マルチオームシーケンシングは、同じ細胞のペアのscRNAおよびATAC-seqデータの取得を可能にする強力なツールとして登場しました。このプロトコルは新しく、壊れやすい、小さい腫瘍の標本を処理することの設.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113