Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

Resumo

O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.

Resumo

O sequenciamento do multioma, que fornece RNA de célula única- mesma célula/pareado e o ensaio para cromatina acessível à transposase com dados de sequenciamento (ATAC-sequenciamento), representa um avanço em nossa capacidade de discernir a heterogeneidade de células tumorais - um foco primário da pesquisa translacional do câncer neste momento. No entanto, a qualidade dos dados de sequenciamento adquiridos com essa modalidade avançada é altamente dependente da qualidade do material de entrada.

As condições de digestão precisam ser otimizadas para maximizar o rendimento celular sem sacrificar a qualidade. Isso é particularmente desafiador no contexto de tumores sólidos com matrizes desmoplásicas densas que devem ser suavemente quebradas para liberação celular. Células recém-isoladas de tecido tumoral sólido são mais frágeis do que aquelas isoladas de linhagens celulares. Além disso, como os tipos celulares isolados são heterogêneos, condições devem ser selecionadas para suportar a população celular total.

Finalmente, as condições de isolamento nuclear devem ser otimizadas com base nessas qualidades em termos de tempos de lise e tipos/proporções de reagentes. Neste artigo, descrevemos nossa experiência com isolamento nuclear para a plataforma de sequenciamento multioma 10x Genomics a partir de espécimes tumorais sólidos. Fornecemos recomendações para digestão de tecidos, armazenamento de suspensões unicelulares (se desejado) e isolamento e avaliação nuclear.

Introdução

À medida que nosso conhecimento da biologia tumoral cresce, a importância de analisar células heterogêneas em todo o microambiente tumoral também tem^aumentado1,2. A capacidade de adquirir RNA de célula única e o ensaio para cromatina acessível à transposase com dados de sequenciamento (ATAC-sequencing) da mesma célula de forma pareada (sequenciamento multioma) proporcionam um avanço significativo nesse sentido ^3,4. No entanto, esses experimentos são caros e demorados, e a qualidade e o impacto dos dados adquiridos são altamente dependentes da qualidade....

Protocolo

Amostras de câncer de pâncreas humano (adenocarcinoma ductal pancreático) foram adquiridas de acordo com um protocolo aprovado pelo IRB em nosso laboratório. Consentimento informado foi obtido dos pacientes para coleta de tecidos. O tecido foi transportado da sala cirúrgica para o laboratório e, em seguida, processado da seguinte forma.

1. Dissociação tecidual (digestão)

1. Prepare o Buffer de Digest (consulte a Tabela de Materiais).
2. Obter o tecido de interesse o mais rápido possível após a excisão do tumor e transportar o espécime em tampão de têmpera (DMEM F-12 com ~5% de soro fetal bovin....

Discussão

Desembaraçar as populações celulares heterogêneas presentes no microambiente tumoral é uma área ativa de foco na biologia do câncer. Da mesma forma, existem tecidos complexos em patologias benignas, como cicatrização de feridas e fibrose. O sequenciamento multioma tem emergido como uma ferramenta poderosa que permite a aquisição de dados de scRNA- e ATAC-seq pareados. Este protocolo descreve o isolamento de núcleos, o que demanda otimização no processamento de espécimes tumorais frescos, frágeis e pequeno.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113