Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

Resumo

O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.

Resumo

O sequenciamento do multioma, que fornece RNA de célula única- mesma célula/pareado e o ensaio para cromatina acessível à transposase com dados de sequenciamento (ATAC-sequenciamento), representa um avanço em nossa capacidade de discernir a heterogeneidade de células tumorais - um foco primário da pesquisa translacional do câncer neste momento. No entanto, a qualidade dos dados de sequenciamento adquiridos com essa modalidade avançada é altamente dependente da qualidade do material de entrada.

As condições de digestão precisam ser otimizadas para maximizar o rendimento celular sem sacrificar a qualidade. Isso é particularmente desafiador no contexto de tumores sólidos com matrizes desmoplásicas densas que devem ser suavemente quebradas para liberação celular. Células recém-isoladas de tecido tumoral sólido são mais frágeis do que aquelas isoladas de linhagens celulares. Além disso, como os tipos celulares isolados são heterogêneos, condições devem ser selecionadas para suportar a população celular total.

Finalmente, as condições de isolamento nuclear devem ser otimizadas com base nessas qualidades em termos de tempos de lise e tipos/proporções de reagentes. Neste artigo, descrevemos nossa experiência com isolamento nuclear para a plataforma de sequenciamento multioma 10x Genomics a partir de espécimes tumorais sólidos. Fornecemos recomendações para digestão de tecidos, armazenamento de suspensões unicelulares (se desejado) e isolamento e avaliação nuclear.

Introdução

À medida que nosso conhecimento da biologia tumoral cresce, a importância de analisar células heterogêneas em todo o microambiente tumoral também tem^aumentado1,2. A capacidade de adquirir RNA de célula única e o ensaio para cromatina acessível à transposase com dados de sequenciamento (ATAC-sequencing) da mesma célula de forma pareada (sequenciamento multioma) proporcionam um avanço significativo nesse sentido ^3,4. No entanto, esses experimentos são caros e demorados, e a qualidade e o impacto dos dados adquiridos são altamente dependentes da qualidade das condições experimentais e dos materiais. Protocolos padronizados para isolamento de núcleos têm sido publicados ^5,6. Tecidos frescos e heterogêneos requerem otimização de protocolo, uma vez que células recém-isoladas de espécimes tumorais sólidos são mais frágeis do que aquelas isoladas de linhagens celulares.

Outra consideração é que, para tumores sólidos, as peças cirúrgicas muitas vezes não estão disponíveis na sala de cirurgia até o final do dia. Como tal, geralmente não é viável proceder diretamente da aquisição da amostra para a captura dos núcleos sem uma etapa de criopreservação. Em nossa experiência, o congelamento de uma suspensão de célula única produz núcleos da mais alta qualidade (em vez de tecido inteiro congelado ou outras modalidades de preservação). Isso é particularmente verdadeiro para tipos de tecidos enzimáticos com alto teor de RNase, como o pâncreas.

As condições de digestão dos tecidos também precisam ser projetadas para maximizar o rendimento celular sem sacrificar a qualidade⁷. No contexto de tumores sólidos com matrizes desmoplásicas^densas8, a matriz extracelular deve ser suavemente quebrada para liberação celular. Além disso, como os tipos celulares isolados são heterogêneos, as condições devem ser ajustadas para suportar a população celular total. Amostras de câncer de pâncreas humano (adenocarcinoma ductal pancreático) são utilizadas no protocolo descrito. O câncer de pâncreas representa um tipo de tumor altamente desmoplásico, que prenuncia tecidos e células relativamente pegajosos. Além disso, como os espécimes de tumores pancreáticos disponíveis para pesquisa também tendem a ser relativamente pequenos, esforços são feitos para maximizar a quantidade de células capturadas.

O isolamento de núcleos requer a maior otimização em termos de condições e tempo de lise celular, bem como tipos e proporções de reagentes. O manuseio dos núcleos ao longo do isolamento também requer muito cuidado. Neste artigo, descrevemos nossa experiência otimizando o isolamento nuclear para a plataforma de sequenciamento multioma 10x Genomics a partir de tecido tumoral sólido (Figura 1). Fornecemos recomendações para digestão de tecidos, criopreservação de suspensões unicelulares (se desejado) e isolamento nuclear.

Protocolo

Amostras de câncer de pâncreas humano (adenocarcinoma ductal pancreático) foram adquiridas de acordo com um protocolo aprovado pelo IRB em nosso laboratório. Consentimento informado foi obtido dos pacientes para coleta de tecidos. O tecido foi transportado da sala cirúrgica para o laboratório e, em seguida, processado da seguinte forma.

1. Dissociação tecidual (digestão)

1. Prepare o Buffer de Digest (consulte a Tabela de Materiais).
2. Obter o tecido de interesse o mais rápido possível após a excisão do tumor e transportar o espécime em tampão de têmpera (DMEM F-12 com ~5% de soro fetal bovino) ou 1x PBS em gelo.
3. Pique o tecido com pinça e tesoura limpas em 3-5 mL de tampão digestivo em uma placa de Petri de 90 mm (Figura 2A).
4. Transfira o tecido picado para um tubo cônico de 50 mL e dissociar em ~10 mL de tampão digesto por 30 min a 37 °C usando um banho-maria com função de agitação ou um agitador seco.
5. Retire do agitador e tempere com ~20 mL de meio de têmpera. Filtrar a solução através de um filtro de células de 100 μm para um tubo cónico limpo.
6. Recolher qualquer tecido sólido remanescente do filtro (repicar os pedaços de tecido restantes, se necessário) e colocar em ~10 ml de tampão Digest fresco durante mais 30 minutos a 37 °C com agitação. Repita até que todo o tecido tumoral tenha sido dissociado.
7. Alíquotas de suspensão de células de piscina e filtre através de um filtro de células de 70 μm seguido por um filtro de células de 40 μm em um tubo cônico limpo sobre gelo.
8. Centrifugar para células de pellet a 500 × g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, decantar o sobrenadante.

2. Criopreservação

1. Enxaguar as células ressuspendendo o pellet em 1 mL de PBS 1x.
2. Transfira a suspensão celular (~1-10 milhões de células/tubo para congelamento ideal) para um criovial de 1,5 mL sobre gelo.
3. Centrifugar para células de pellet a 500 × g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, decantar o sobrenadante.
4. Ressuspender as células em 1 mL de solução de Bambanker, transferir para um criovial de 1,5 ou 2 mL (Figura 2B) e congelar usando um recipiente de congelação com taxa de resfriamento de -1 °C/min (contendo álcool isopropílico a 100%) a -80 °C, ou transferir para nitrogênio líquido se o armazenamento a longo prazo da amostra for previsto.

3. Isolamento de núcleos

1. Descongele rapidamente o criovial da suspensão celular e coloque-o sobre gelo molhado.
2. Transfira a suspensão celular descongelada para um tubo de microcentrífuga de 2 ml e complete o frasco para injetáveis para 2 ml de solução com 1x PBS para enxaguar as células.
3. Obter uma contagem manual de células usando um hemocitômetro para avaliar tanto a quantidade quanto a qualidade das células (Figura 2C).
4. Centrifugar para células de pellet a 500 × g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, decantar suavemente o sobrenadante utilizando pontas de pipeta progressivamente mais pequenas para deixar para trás um pellet seco e mantê-lo no gelo.
   1. Use um rotor de caçamba oscilante para todas as etapas de centrifugação. Para obter o máximo rendimento celular, coloque os tubos na centrífuga com a dobradiça voltada para fora e, em seguida, decante com a ponta da pipeta direcionada para o lado oposto do tubo (Figura 2D).
      NOTA: Para decantar o sobrenadante, use pontas de pipeta progressivamente menores para remover o fluido para limitar a ruptura do pellet enquanto maximiza o volume de fluido decantado. Esta estratégia é particularmente útil mais tarde no protocolo após a extração dos núcleos, uma vez que a pelota dos núcleos geralmente não é visível.
5. Prepare 1x Cell Lysis Buffer, Cell Lysis Dilution Buffer e Wash Buffer (Figura 3A) de acordo com o protocolo publicado com as seguintes modificações (ver Tabela 1, Tabela de Materiais):
   NOTA: Coloque o Digitonin num bloco de aquecimento a 65 °C antes de utilizar para dissolver o precipitado (figura 3B). Isso normalmente leva cerca de 10 minutos.
6. Prepare o tampão de lise celular de 0,1x combinando 100 μL de 1x tampão de lise celular e 900 μL de tampão de diluição de lise celular, pipetar suavemente para misturar e colocá-lo no gelo.
7. Ressuspenda o pellet de células em 100 μL de tampão de lise celular 0,1x resfriado e pipete suavemente para misturar 5x.
8. Incubar no gelo por 3 min (Figura 3C).
9. Adicione 1 mL de tampão de lavagem resfriado e pipete para cima e para baixo para misturar suavemente 5x.
10. Centrifugar para pellet os núcleos a 500 × g durante 5 min a 4 °C, decantar suavemente o sobrenadante para um pellet seco e manter no gelo.
    NOTA: Se o número inicial de células for baixo (100.000-200.000 células), execute as etapas de lise e lavagem celular em um tubo de PCR de 200 μL em vez de um tubo de microcentrífuga de 2 mL para diminuir a área de superfície do tubo e minimizar as perdas. Nesse caso, ajuste o volume do Buffer de lavagem para baixo para acomodar o volume menor do tubo.
11. Repita as etapas 3.9-3.10 2x para um total de três lavagens.
12. Conte manualmente os núcleos usando uma lâmina de hemocitômetro sob o microscópio. Use corante azul de tripano se desejado para fornecer contraste para visualizar os núcleos e para ajudar a discernir núcleos de células não lisadas.
13. Prepare o 1x Nuclei Buffer de acordo com o protocolo publicado: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM TDT, 1 U/μL RNase Inhibitor em água nuclease-free e mantenha no gelo (ver Tabela de Materiais).
14. Ressuspenda a pelota de núcleos em 1x Nuclei Buffer com base na recuperação de núcleos alvo de meta.
    NOTA: Se a concentração for suficientemente elevada, procure uma recuperação visada de 10.000 ou ligeiramente superior nesta etapa (3.230-8.060 núcleos/μL) ao determinar o volume de ressuspensão inicial, dada a perda de volume prevista de 25 μL e a diminuição de 20% da concentração com filtragem (Passo 3.15).
15. Passe suavemente o volume dos núcleos ressuspensos através de um filtro de células de ponta de pipeta de 40 μm e coloque os núcleos no gelo (Figura 3D).
16. Reconte os núcleos (Figura 4A-C). Diluir ainda mais a solução final com Nuclei Buffer, se necessário.
17. Transportar os núcleos no gelo e proceder imediatamente à captura dos núcleos de acordo com os protocolos publicados.

Resultados

Para isolar núcleos de alta qualidade de espécimes tumorais sólidos de pacientes para sequenciamento do multioma (Figura 1), o tecido tumoral foi dissociado e uma suspensão unicelular foi criopreservada (Figura 2A-D). A suspensão celular foi então descongelada no momento da captura planejada do mulômeno. A captura dos núcleos foi realizada com reagentes de tampão de lise otimizados e temporização para maximizar a qual...

Discussão

Desembaraçar as populações celulares heterogêneas presentes no microambiente tumoral é uma área ativa de foco na biologia do câncer. Da mesma forma, existem tecidos complexos em patologias benignas, como cicatrização de feridas e fibrose. O sequenciamento multioma tem emergido como uma ferramenta poderosa que permite a aquisição de dados de scRNA- e ATAC-seq pareados. Este protocolo descreve o isolamento de núcleos, o que demanda otimização no processamento de espécimes tumorais frescos, frágeis e pequeno...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers	ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	499609
Collagenase (Collagenase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113