التفكك الميكانيكي للأنسجة لتحليل الخلية المفردة باستخدام جهاز آلي

Summary

يتم توفير بروتوكول عام للتفكك الميكانيكي الأنزيمي وشبه الآلي المشترك للأنسجة لتوليد معلقات أحادية الخلية للتحليلات النهائية ، مثل قياس التدفق الخلوي. يتم تضمين تعليمات لتصنيع وتجميع وتشغيل الجهاز الميكانيكي منخفض التكلفة الذي تم تطويره لهذا البروتوكول.

Abstract

أصبحت القدرة على عزل الخلايا المفردة وإعدادها لتحليل عينات الأنسجة أمرا بالغ الأهمية للاكتشافات والأبحاث الطبية الحيوية الجديدة. تستغرق البروتوكولات اليدوية لعمليات عزل الخلية الواحدة وقتا طويلا للغاية وعرضة لتنوع المستخدم. البروتوكولات الميكانيكية الآلية قادرة على تقليل وقت المعالجة وتنوع العينات ولكن لا يمكن الوصول إليها بسهولة أو فعالة من حيث التكلفة في إعدادات البحث منخفضة الموارد. تم تصميم الجهاز الموصوف هنا لتفكك الأنسجة شبه الآلي باستخدام المواد المتاحة تجاريا كبديل منخفض التكلفة للمختبرات الأكاديمية. تم توفير تعليمات لتصنيع وتجميع وتشغيل تصميم الجهاز. ينتج بروتوكول التفكك بشكل موثوق معلقات أحادية الخلية مع إنتاجية خلايا مماثلة وصلاحية عينة للمستحضرات اليدوية عبر أنسجة الفئران المتعددة. يوفر البروتوكول القدرة على معالجة ما يصل إلى 12 عينة من الأنسجة في وقت واحد لكل جهاز ، مما يجعل الدراسات التي تتطلب أحجام عينات كبيرة أكثر قابلية للإدارة. يسمح البرنامج المصاحب أيضا بتخصيص بروتوكول الجهاز لاستيعاب الأنسجة المختلفة والقيود التجريبية.

Introduction

أصبح تحليل الخلية الواحدة سريعا أمرا بالغ الأهمية للاكتشافات الطبية الحيوية الجديدة ، سواء لتطبيقات مثل قياس التدفق الخلوي ، وتحديد أنواع الخلايا المختلفة ، أو تسلسل الخلية الواحدة ، أو لتحديد الاختلافات الجينومية أو النسخية بين الخلايا¹. يتطلب إجراء عمليات عزل الخلايا هذه من الأنسجة ذات الأهمية فرم الأنسجة المقطعة ودفعها عبر مصفاة خلايا دقيقة لتصفية النسيج الضام من الخلايا المرغوبة (الشكل 1 أ). يتطلب عزل أنواع الخلايا الملتصقة ، مثل الخلايا المتغصنة أو الضامة ، أو الخلايا من الأنسجة الليفية بشكل خاص ، خطوات فصل ميكانيكية أو إنزيمية إضافية^2،3،4. تتم هذه العملية يدويا بشكل عام ، مما يجعلها تستغرق وقتا طويلا وعرضة لتقلب المستخدم عند تقييم إنتاجية الخلايا وصلاحية العينة. لذلك ، من الأهمية بمكان تقديم خيارات قابلة للتخصيص لتفكك الأنسجة الآلي. في حين بذلت بعض المحاولات لتصميم مثل هذه الأنظمة ، فإن الخيارات الحالية لا يمكن الوصول إليها دائما بسهولة ، لا سيما في المختبرات الأكاديمية والإعدادات ذات الموارد المنخفضة ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الطبيعة الباهظة التكلفة لهذه الأجهزة⁵. علاوة على ذلك ، لا تكون هذه الأجهزة قابلة للتخصيص دائما وفقا للاحتياجات الفردية لمجموعة البحث⁶.

هنا ، تم تصميم جهاز فك الأنسجة لأتمتة هضم الأنسجة الكاملة أو قطع الأنسجة في معلقات أحادية الخلية بمساعدة الإنزيمات الهاضمة والاضطراب الميكانيكي. يمكن تجميع هذا الجهاز بسهولة في المختبر ، ووضعه في غرف التدفئة أو التبريد لتنظيم درجة الحرارة ، وتخصيصه للعدد المطلوب من الأنسجة لفصلها ، وبرمجته ببروتوكولات التفكك المطلوبة. يمكن أن يؤدي الاستخدام الواسع لهذا الجهاز إلى تحسين إمكانية استنساخ بروتوكولات استخراج الخلايا بشكل كبير وتوفير بديل موفر للوقت للتفكك اليدوي.

يسمح التصميم بالهضم المتزامن لما يصل إلى 12 منديلا من خلال عملية آلية. يتكون الجهاز من 12 محركا فرديا سلكيا بالتوازي ويتم تشغيله بواسطة قابس حائط قياسي من خلال محول AC / DC مع قرص جهد قابل للتعديل للتحكم في دوران / سرعة المحركات. تقوم المحركات بتحويل مسمار سداسي يتناسب بشكل مريح مع الجزء العلوي من الأنابيب C. يتم تثبيت الأنابيب C في مكانها عن طريق الشد لأسفل على لوحة أكريليك تغلق على جانبي اللوحة العلوية حيث يتم تأمين المحركات (الشكل 1 ب). نظرا لأن المحركات سلكية بالتوازي ، يجب ألا تختلف سرعتها عند أي جهد معين كثيرا ، ولكن الحمل (عدد الأنابيب C المثبتة على الجهاز) سيؤثر على السرعة حتى عندما يظل الجهد ثابتا. لقياس الدورات في الدقيقة (rpm) ، تم دمج مقياس سرعة الدوران باستخدام مستشعر تأثير القاعة ومغناطيس ثابت على أحد أعمدة المحرك (الشكل التكميلي 1). يتم توفير ملفات CAD لبناء صفائف المحركات في ملف الترميز التكميلي 1. كما يشتمل على مفتاح قابل للبرمجة لعكس اتجاه الدوران عن طريق عكس الشحنات الموجبة / السالبة التي يتم تسليمها إلى المحركات. تم دمج كل هذه الميزات باستخدام برنامج مشفر (برنامج Arduino IDE ، انظر جدول المواد) على Arduino Nano (ملف الترميز التكميلي 2). باستخدام الأزرار المتصلة ولوحة LCD (الشكل التكميلي 2) ، من الممكن إنشاء وتشغيل بروتوكولات محفوظة ومخصصة ، وعكس اتجاه الدوران تلقائيا في أوقات محددة من البروتوكول ، وضبط السرعة باستخدام الجهد (الشكل التكميلي 3) ، وعرض سرعة المحرك الحالية والوقت المتبقي لإكمال بروتوكول مبرمج (الشكل التكميلي 4).

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم تحضير معلقات أحادية الخلية باستخدام كل من تفكك الأنسجة الأنزيمية الميكانيكية مع هذا الجهاز وتفكك الأنسجة الأنزيمية اليدوية لتحديد الاختلافات ، إن وجدت ، في الخلايا المستعادة للتطبيقات النهائية. تم تقييم الاستعدادات الخلوية على أساس إجمالي غلة الخلايا لكل نسيج والنسبة المئوية لصلاحية الخلية. تم استخدام قياس التدفق الخلوي لمقارنة الاختلافات المحتملة في تعبير علامة السطح. تم تحليل البيانات باستخدام الرسوم البيانية وبرامج التحليل الإحصائي. تم استخدام اختبارات Welch t غير المزاوجة لمقارنة أزواج من العينات أو المجموعات ، مع أحجام العينات n > 4 الفئران التي تمثل 2 تجربة تكرار. يمكن العثور على تعليمات مفصلة لتصنيع وتجميع هذا الجهاز في الملف التكميلي 1. يتم سرد المواد اللازمة لهذا البروتوكول في جدول المواد.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية UMD (IACUC). تم استخدام الأنسجة من إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 7 إلى 9 أسابيع لهذه الدراسات. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. التفكك اليدوي

ملاحظة: هذه الخطوة مقتبسة من Maisel K. et ^al.7.

1. قم بإزالة الأنسجة المقطعة وضعها في وسط زراعة الخلايا الباردة باستخدام مصل بقري الجنين بنسبة 5٪ (FBS).
2. اقطع الأنسجة باستخدام مقص تشريح حاد حتى تصبح الشظايا أصغر من 1 مم في أي بعد.
3. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 5 مل من الوسائط.
4. أضف إنزيمات الهضم بناء على أنواع الأنسجة والخلايا المعزولة. بالنسبة للتجارب المقدمة ، استخدم كولاجيناز 4 (1 مجم / مل) ، كولاجيناز د (1 مجم / مل) ، و DNase (40 ميكروغرام / مل).
5. احتضان على شاكر أو الروك لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع تحريض لطيف في جميع أنحاء الحضانة. ماصة العينة صعودا وهبوطا 100 مرة.
6. أضف EDTA لتحقيق حجم عينة بتركيز 5 mM. ماصة العينة لأعلى ولأسفل 100 مرة ، ثم ماصة بقوة العينة لأعلى ولأسفل 100 مرة.
7. مرر العينة عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر واجمعها في أنبوب سعة 50 مل أو 15 مل.
8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المجمعة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء. احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. تحييد المخزن المؤقت للتحلل عن طريق إضافة 9 مل من محلول ملحي بارد 1X فوسفات (PBS).
10. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المجمعة مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت أو الوسائط المطلوبة.

2. التفكك الميكانيكي شبه الآلي

1. ضع الأنسجة المقطعة في وسط زراعة الخلايا الباردة مع مصل بقري الجنين بنسبة 5٪ (FBS).
   ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص لعزل الخلايا عن الأنسجة الصلبة.
2. اقطع المنديل باستخدام مقص تشريح حاد حتى تصبح شظايا الأنسجة حوالي 5 مم في أي بعد. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب C وأضف 1 مل من الوسائط.
3. قم بتحميل الأنبوب C على الجهاز. قم بتركيب لوحة حامل الأنبوب (الشكل التكميلي 1 أ) فوق قيعان الأنبوب على شكل حرف D.
4. ثبت الأنابيب بلوحة المحرك عن طريق تثبيت أذرع الشد في لوحة الأكريليك (الشكل التكميلي 3).
5. تعيين برنامج مخصص: إلى الأمام ، 30 ثانية ؛ عكس ، 10 ثانية ؛ حلقة ، 4 مرات.
   1. اختر الوضع المخصص من القائمة الرئيسية بالضغط على الزر الأزرق .
   2. في قائمة الوضع المخصص الأولى ، حدد مدة الدوران الأمامي إلى 30 ثانية بالضغط على الزر الأحمر حتى تقرأ القيمة على الشاشة 30 ثانية. اضغط على الزر الأزرق لتحديد هذه القيمة والتقدم إلى شاشة القائمة التالية.
   3. في قائمة الوضع المخصص الثانية ، حدد مدة الدوران العكسي إلى 10 ثوان بالضغط على الزر الأحمر حتى تقرأ القيمة على الشاشة 10 ثوان. اضغط على الزر الأزرق لتحديد هذه القيمة والتقدم إلى شاشة القائمة التالية.
   4. في قائمة الوضع المخصص الثالثة ، حدد عدد المرات لتكرار التحديدات المحددة في الخطوات 2.5.2-2.5.3 بالضغط على الزر الأحمر حتى تقرأ القيمة على الشاشة 4X. اضغط على الزر الأزرق لتحديد هذه القيمة وبدء تشغيل البرنامج.
      ملاحظة: لا يتم تخزين البرامج المخصصة في ذاكرة الجهاز ولكن يمكن برمجتها كأحد البرامج المعدة مسبقا للتشغيل بشكل أسرع (يتم توفير إرشادات برمجة الجهاز في الملف التكميلي 1).
6. قم بتشغيل البرنامج المخصص عند 200 دورة في الدقيقة عن طريق ضبط قرص التحكم في الجهد (الشكل التكميلي 3) حتى تقرأ قيمة عدد الدورات في الدقيقة المحسوبة في الزاوية اليمنى السفلية من شاشة LCD 200 (الشكل التكميلي 4).
7. أضف إنزيمات الهضم في وسائط 4 مل وفقا لأنواع الأنسجة والخلايا المعزولة.
   ملاحظة: بالنسبة للتجارب المقدمة ، استخدم كولاجيناز 4 (1 مجم / مل) ، كولاجيناز د (1 مجم / مل) ، و DNase (40 ميكروغرام / مل).
8. قم بتحميل الأنبوب C على الجهاز وكرر الخطوات 2.3-2.6 لتشغيل البرنامج التالي عند 200 دورة في الدقيقة: إلى الأمام ، 30 ثانية ؛ عكس ، 10 ثانية ؛ حلقة ، 4 مرات.
9. انقل الجهاز مع استمرار تحميل الأنابيب إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
10. قم بتحميل الأنبوب C على الجهاز وكرر الخطوات 2.3-2.6 لتشغيل البرنامج التالي عند 50 دورة في الدقيقة: إلى الأمام ، 270 ثانية ؛ عكس ، 30 ثانية ؛ حلقة ، 9 مرات.
11. أضف EDTA لتحقيق تركيز 5 mM في العينة.
12. قم بتحميل الأنبوب C على الجهاز وكرر الخطوات 2.3-2.6 لتشغيل البرنامج التالي عند 100 دورة في الدقيقة: إلى الأمام ، 30 ثانية ؛ عكس ، 10 ثانية ؛ حلقة ، 2 مرات.
13. ادفع العينة عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر واجمعها في أنبوب سعة 50 مل أو 15 مل.
14. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المجمعة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء. احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
15. تحييد المخزن المؤقت للتحلل باستخدام 9 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS).
16. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المجمعة مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت أو الوسائط المطلوبة.

3. تحليل البيانات

1. تحليل البيانات باستخدام برنامج الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي (انظر جدول المواد).
2. استخدم اختبارات Welch t غير المقترنة لمقارنة أزواج من العينات أو المجموعات ، مع أحجام العينات n > 4 الفئران التي تمثل 2 تكرار التجارب.
   ملاحظة: اعتبرت الفروق ذات دلالة إحصائية عند (p < 0.05). * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001.

النتائج

يمكن لهذا البروتوكول الميكانيكي شبه الآلي تكرار نتائج التجارب التي تمت فيها معالجة الخلايا يدويا. تظهر معلقات الخلايا المحضرة باستخدام هذا الجهاز وعن طريق التفكك اليدوي إنتاجية خلايا مماثلة وصلاحية عينة عبر رئة الفأر والكلى وأنسجة القلب (الشكل 2 أ ، ب). لم تتأثر م...

Discussion

تم تصميم هذا الجهاز لسهولة التجميع في إعداد البحث لتوفير معلقات أحادية الخلية من الأنسجة الكاملة لتحليل الخلية الواحدة لاحقا. الميزات ، على الرغم من أنها أساسية ، كافية لتلبية احتياجات الباحثين في البيئات الأكاديمية وخارجها. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لاستخدام هذا الجهاز في قدرته على ت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3