Механическая диссоциация тканей для анализа одиночных клеток с помощью моторизованного устройства

Резюме

Представлен общий протокол комбинированной ферментативной и полуавтоматической механической диссоциации тканей с получением одноклеточных суспензий для последующего анализа, такого как проточная цитометрия. В книгу включены инструкции по изготовлению, сборке и эксплуатации недорогого механического устройства, разработанного для этого протокола.

Аннотация

Возможность изолировать и подготавливать отдельные клетки для анализа образцов тканей быстро стала решающей для новых биомедицинских открытий и исследований. Ручные протоколы для изоляции отдельных клеток отнимают много времени и подвержены изменчивости пользователя. Автоматизированные механические протоколы способны сократить время обработки и вариабельность образцов, но они не являются легкодоступными или экономически эффективными в условиях исследований с ограниченными ресурсами. Описанное здесь устройство было разработано для полуавтоматической диссоциации тканей с использованием коммерчески доступных материалов в качестве недорогой альтернативы для академических лабораторий. Приведены инструкции по изготовлению, сборке и эксплуатации конструкции устройства. Протокол диссоциации надежно позволяет получать одноклеточные суспензии с сопоставимым выходом клеток и жизнеспособностью образца с ручным приготовлением в нескольких тканях мыши. Протокол обеспечивает возможность одновременной обработки до 12 образцов тканей на одно устройство, что делает исследования, требующие больших размеров выборки, более управляемыми. Сопутствующее программное обеспечение также позволяет настраивать протокол устройства для адаптации к различным тканям и экспериментальным ограничениям.

Введение

Анализ отдельных клеток быстро приобрел решающее значение для новых биомедицинских открытий, будь то такие приложения, как проточная цитометрия, идентификация различных типов клеток, секвенирование отдельных клеток или выявление геномных или транскриптомных вариаций^{между клетками}. Для выделения таких клеток из интересующих тканей необходимо измельчить рассеченные ткани и пропустить их через мелкое клеточное ситечко, чтобы отфильтровать соединительную ткань из нужных клеток (рис. 1А). Выделение адгезивных типов клеток, таких как дендритные клетки или макрофаги, или клетки из особо волокнистых тканей, требует дополни....

протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) UMD. Для этих исследований использовались ткани самок мышей C57BL/6J в возрасте от 7 до 9 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Ручная диссоциация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг адаптирован из Maisel K. et ^al.7.

1. Удалить рассеченную ткань и поместить ее в холодную питательную среду с 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
2. Измельчите ткань острыми ножницами для препарирования до тех пор, пока фрагменты не станут меньш....

Результаты

Этот полуавтоматический механический протокол может воспроизводить результаты экспериментов, в которых клетки обрабатывались вручную. Клеточные суспензии, приготовленные с помощью этого устройства и путем ручной диссоциации, показывают сопоставимый выход клеток и жизнеспособност?.......

Обсуждение

Это устройство было разработано для легкой сборки в исследовательских условиях для получения одноклеточных суспензий из цельных тканей для последующего анализа отдельных клеток. Эти функции, хотя и являются базовыми, достаточны для удовлетворения потребностей исследователей в акад?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3