Механическая диссоциация тканей для анализа одиночных клеток с помощью моторизованного устройства

Резюме

Представлен общий протокол комбинированной ферментативной и полуавтоматической механической диссоциации тканей с получением одноклеточных суспензий для последующего анализа, такого как проточная цитометрия. В книгу включены инструкции по изготовлению, сборке и эксплуатации недорогого механического устройства, разработанного для этого протокола.

Аннотация

Возможность изолировать и подготавливать отдельные клетки для анализа образцов тканей быстро стала решающей для новых биомедицинских открытий и исследований. Ручные протоколы для изоляции отдельных клеток отнимают много времени и подвержены изменчивости пользователя. Автоматизированные механические протоколы способны сократить время обработки и вариабельность образцов, но они не являются легкодоступными или экономически эффективными в условиях исследований с ограниченными ресурсами. Описанное здесь устройство было разработано для полуавтоматической диссоциации тканей с использованием коммерчески доступных материалов в качестве недорогой альтернативы для академических лабораторий. Приведены инструкции по изготовлению, сборке и эксплуатации конструкции устройства. Протокол диссоциации надежно позволяет получать одноклеточные суспензии с сопоставимым выходом клеток и жизнеспособностью образца с ручным приготовлением в нескольких тканях мыши. Протокол обеспечивает возможность одновременной обработки до 12 образцов тканей на одно устройство, что делает исследования, требующие больших размеров выборки, более управляемыми. Сопутствующее программное обеспечение также позволяет настраивать протокол устройства для адаптации к различным тканям и экспериментальным ограничениям.

Введение

Анализ отдельных клеток быстро приобрел решающее значение для новых биомедицинских открытий, будь то такие приложения, как проточная цитометрия, идентификация различных типов клеток, секвенирование отдельных клеток или выявление геномных или транскриптомных вариаций^{между клетками}. Для выделения таких клеток из интересующих тканей необходимо измельчить рассеченные ткани и пропустить их через мелкое клеточное ситечко, чтобы отфильтровать соединительную ткань из нужных клеток (рис. 1А). Выделение адгезивных типов клеток, таких как дендритные клетки или макрофаги, или клетки из особо волокнистых тканей, требует дополнительных этапов механического или ферментативного разделения ^2,3,4. Этот процесс, как правило, выполняется вручную, что делает его очень трудоемким и подверженным изменчивости пользователя при оценке выхода клеток и жизнеспособности образцов. Поэтому крайне важно внедрить настраиваемые опции для автоматизированной диссоциации тканей. Несмотря на то, что были предприняты некоторые попытки спроектировать такие системы, существующие варианты не всегда легко доступны, особенно в академических лабораториях и странах с ограниченными ресурсами, в основном из-за непомерно дорогого характера^{этих устройств.} Кроме того, эти устройства не всегда могут быть адаптированы к индивидуальным потребностям исследовательской группы⁶.

Здесь было разработано устройство диссоциатора тканей для автоматизации переваривания целых тканей или кусочков тканей в одноклеточные суспензии с помощью пищеварительных ферментов и механического разрушения. Это устройство может быть легко собрано в лаборатории, помещено в нагревательные или охлаждающие камеры для регулирования температуры, настроено на необходимое количество тканей для диссоциации и запрограммировано с помощью желаемых протоколов диссоциации. Широкое использование этого устройства может значительно улучшить воспроизводимость протоколов экстракции клеток и обеспечить экономящую время альтернативу ручной диссоциации.

Конструкция позволяет одновременно расщеплять до 12 тканей с помощью автоматизированного процесса. Устройство состоит из 12 отдельных двигателей, подключенных параллельно и питаемых от стандартной розетки через адаптер переменного/постоянного тока с регулируемым регулятором напряжения для управления вращением/скоростью двигателей. Двигатели поворачивают болт с шестигранной головкой, который плотно входит в верхнюю часть С-образных трубок. С-образные трубки удерживаются на месте за счет натяжения вниз на акриловой пластине, которая защелкивается с обеих сторон к верхней пластине, где закреплены двигатели (Рисунок 1B). Поскольку двигатели подключены параллельно, их скорость при любом заданном напряжении не должна сильно меняться, но нагрузка (количество С-образных трубок, установленных на устройстве) будет влиять на скорость, даже если напряжение поддерживается постоянным. Для измерения оборотов в минуту (об/мин) был встроен тахометр с датчиком Холла и неподвижным магнитом на одном из валов двигателя (дополнительный рисунок 1). Файлы САПР для построения массивов двигателей приведены в Дополнительном файле кодирования 1. Также в комплект входит программируемый переключатель для изменения направления вращения путем изменения местами положительных/отрицательных зарядов, подаваемых на двигатели. Все эти функции интегрированы с помощью закодированного программного обеспечения (программное обеспечение Arduino IDE, см. Таблицу материалов) на Arduino Nano (Дополнительный файл кодирования 2). С помощью подключенных кнопок и ЖК-панели (дополнительный рисунок 2) можно создавать и запускать сохраненные и пользовательские протоколы, автоматически менять направление вращения в заданное время протокола, регулировать скорость с помощью напряжения (дополнительный рисунок 3) и отображать текущую скорость двигателя и время, оставшееся до завершения запрограммированного протокола (дополнительный рисунок 4).

Для настоящего исследования одноклеточные суспензии были приготовлены с использованием как механической ферментативной диссоциации тканей с помощью этого устройства, так и ручно-ферментативной диссоциации тканей для определения различий, если таковые имеются, в клетках, извлеченных для последующего применения. Клеточные препараты оценивали на основе общего выхода клеток на ткань и процента жизнеспособности клеток. Для сравнения различий потенциалов в экспрессии поверхностных маркеров использовали проточную цитометрию. Данные анализировались с помощью программного обеспечения для построения графиков и статистического анализа. Для сравнения пар образцов или групп использовались непарные t-критерии Уэлча, при этом размеры выборки от > 4 мышей представляли собой 2 повторных эксперимента. Подробные инструкции по изготовлению и сборке этого устройства можно найти в Дополнительном файле 1. Материалы, необходимые для этого протокола, перечислены в Таблице материалов.

протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) UMD. Для этих исследований использовались ткани самок мышей C57BL/6J в возрасте от 7 до 9 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Ручная диссоциация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг адаптирован из Maisel K. et ^al.7.

1. Удалить рассеченную ткань и поместить ее в холодную питательную среду с 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
2. Измельчите ткань острыми ножницами для препарирования до тех пор, пока фрагменты не станут меньше 1 мм в любом размере.
3. Переложите измельченную ткань в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 5 мл среды.
4. Добавьте пищеварительные ферменты в зависимости от типов тканей и клеток, которые выделяются. Для представленных экспериментов используют коллагеназу 4 (1 мг/мл), коллагеназу D (1 мг/мл) и ДНКазу (40 мкг/мл).
5. Инкубируют на шейкере или коромысле в течение 1 ч при 37 °C при легком перемешивании на протяжении всей инкубации. Пипеткой вверх и вниз по образцу 100 раз.
6. Добавьте ЭДТА, чтобы получить объем образца с концентрацией 5 мМ. Пипетируйте образец вверх и вниз 100 раз, а затем энергично пипетируйте образец вверх и вниз 100 раз.
7. Пропустите образец через ситечко с ячейками 70 мкм и соберите его в пробирку объемом 50 мл или 15 мл.
8. Центрифугируют собранные клетки при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера для лизиса эритроцитов. Выдерживать 1 мин при комнатной температуре.
9. Нейтрализуйте лизисный буфер, добавив 9 мл холодного 1X фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
10. Снова центрифугируют собранные клетки при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно поместите клетки в нужный буфер или среду.

2. Полуавтоматическая механическая диссоциация

1. Помещают рассеченную ткань в холодную питательную среду с 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для выделения клеток из твердых тканей.
2. Измельчите ткань острыми ножницами для препарирования до тех пор, пока фрагменты ткани не станут примерно 5 мм в любом размере. Переложите измельченную ткань в С-образную трубку и добавьте 1 мл среды.
3. Загрузите С-образную трубку в устройство. Установите пластину держателя трубки (дополнительный рисунок 1A) на D-образное дно трубки.
4. Прикрепите трубки к пластине двигателя, защелкнув натяжные рычаги в акриловой пластине (дополнительный рисунок 3).
5. Установка пользовательской программы: Вперед, 30 с; Реверс, 10 с; Петля, 4 раза.
   1. Выберите «Пользовательский режим » в главном меню , нажав синюю кнопку.
   2. В первом меню пользовательского режима укажите длительность вращения вперед до 30 с, нажимая красную кнопку до тех пор, пока значение на экране не покажет 30 с. Нажмите синюю кнопку, чтобы выбрать это значение и перейти к следующему экрану меню.
   3. Во втором меню пользовательского режима укажите длительность обратного вращения до 10 с, нажимая красную кнопку до тех пор, пока значение на экране не покажет 10 с. Нажмите синюю кнопку, чтобы выбрать это значение и перейти к следующему экрану меню.
   4. В третьем меню пользовательского режима укажите количество раз для повторения выбора, установленного на шагах 2.5.2-2.5.3, нажимая красную кнопку до тех пор, пока значение на экране не станет 4X. Нажмите синюю кнопку, чтобы выбрать это значение и запустить программу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пользовательские программы не сохраняются в памяти устройства, но могут быть запрограммированы в качестве одной из предустановленных программ для более быстрой работы (инструкции по программированию устройства приведены в дополнительном файле 1).
6. Запустите пользовательскую программу при 200 об/мин, регулируя диск управления напряжением (дополнительный рисунок 3) до тех пор, пока рассчитанное значение оборотов в правом нижнем углу ЖК-экрана не достигнет 200 (дополнительный рисунок 4).
7. Добавьте пищеварительные ферменты в среду по 4 мл в соответствии с типами тканей и клеток, которые выделяются.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для представленных экспериментов используйте коллагеназу 4 (1 мг/мл), коллагеназу D (1 мг/мл) и ДНКазу (40 мкг/мл).
8. Загрузите С-образную трубку в устройство и повторите шаги 2.3-2.6, чтобы запустить следующую программу при 200 об/мин: Вперед, 30 с; Реверс, 10 с; Петля, 4 раза.
9. Переместите устройство с загруженными пробирками в инкубатор с температурой 37 °C на 45 минут.
10. Загрузите С-образную трубку в устройство и повторите шаги 2.3-2.6, чтобы запустить следующую программу при 50 об/мин: Вперед, 270 с; Реверс, 30 с; Петля, 9 раз.
11. Добавьте ЭДТА для достижения концентрации 5 мМ в образце.
12. Загрузите С-образную трубку в устройство и повторите шаги 2.3-2.6, чтобы запустить следующую программу при 100 об/мин: Вперед, 30 с; Реверс, 10 с; Петля, 2 раза.
13. Протолкните образец через ситечко с ячейками 70 мкм и соберите его в пробирку объемом 50 мл или 15 мл.
14. Центрифугируют собранные клетки при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте клетки в 1 мл буфера для лизиса эритроцитов. Выдерживать 1 мин при комнатной температуре.
15. Нейтрализуйте буфер для лизиса с помощью 9 мл холодного фосфатного буферного раствора (PBS).
16. Снова центрифугируют собранные клетки при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте клетки в нужном буфере или среде.

3. Анализ данных

1. Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для построения графиков и статистического анализа (см. Таблицу материалов).
2. Используйте непарные t-критерии Уэлча для сравнения пар выборок или групп, при этом размеры выборки от > 4 мышей представляют 2 повторных эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различия считались статистически значимыми, когда (р < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Результаты

Этот полуавтоматический механический протокол может воспроизводить результаты экспериментов, в которых клетки обрабатывались вручную. Клеточные суспензии, приготовленные с помощью этого устройства и путем ручной диссоциации, показывают сопоставимый выход клеток и жизнеспособност?...

Обсуждение

Это устройство было разработано для легкой сборки в исследовательских условиях для получения одноклеточных суспензий из цельных тканей для последующего анализа отдельных клеток. Эти функции, хотя и являются базовыми, достаточны для удовлетворения потребностей исследователей в акад?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3