Mechanische Dissoziation von Geweben für die Einzelzellanalyse mit einem motorisierten Gerät

Zusammenfassung

Es wird ein allgemeines Protokoll für die kombinierte enzymatische und halbautomatische mechanische Dissoziation von Geweben zur Erzeugung von Einzelzellsuspensionen für nachgeschaltete Analysen, wie z. B. die Durchflusszytometrie, bereitgestellt. Anweisungen für die Herstellung, Montage und den Betrieb der kostengünstigen mechanischen Vorrichtung, die für dieses Protokoll entwickelt wurde, sind enthalten.

Zusammenfassung

Die Möglichkeit, einzelne Zellen für die Analyse von Gewebeproben zu isolieren und vorzubereiten, ist für neue biomedizinische Entdeckungen und Forschungen schnell entscheidend geworden. Manuelle Protokolle für Einzelzellisolierungen sind sehr zeitaufwändig und anfällig für Benutzervariabilität. Automatisierte mechanische Protokolle sind in der Lage, die Verarbeitungszeit und die Probenvariabilität zu reduzieren, sind aber in Forschungsumgebungen mit geringeren Ressourcen nicht leicht zugänglich oder kostengünstig. Das hier beschriebene Gerät wurde für die halbautomatische Gewebedissoziation unter Verwendung kommerziell erhältlicher Materialien als kostengünstige Alternative für akademische Labore entwickelt. Anweisungen zur Herstellung, Montage und Bedienung des Gerätedesigns wurden bereitgestellt. Das Dissoziationsprotokoll erzeugt zuverlässig Einzelzellsuspensionen mit vergleichbaren Zellausbeuten und Probenviabilität wie manuelle Präparationen über mehrere Mausgewebe. Das Protokoll bietet die Möglichkeit, bis zu 12 Gewebeproben gleichzeitig pro Gerät zu verarbeiten, wodurch Studien, die große Probengrößen erfordern, leichter zu bewältigen sind. Die mitgelieferte Software ermöglicht auch die Anpassung des Geräteprotokolls, um unterschiedliche Gewebe und experimentelle Einschränkungen zu berücksichtigen.

Einleitung

Die Einzelzellanalyse ist für neue biomedizinische Entdeckungen schnell von entscheidender Bedeutung geworden, sei es für Anwendungen wie die Durchflusszytometrie, die Identifizierung verschiedener Zelltypen, die Einzelzellsequenzierung oder die Identifizierung genomischer oder transkriptomischer Variationen zwischen Zellen¹. Die Durchführung solcher Zellisolierungen aus Geweben von Interesse erfordert das Zerkleinern von präpariertem Gewebe und das Schieben durch ein feines Zellsieb, um das Bindegewebe aus den gewünschten Zellen herauszufiltern (Abbildung 1A). Die Isolierung adhärenter Zelltypen, wie dendritische Zellen oder Makrophagen, oder Zellen aus besonders faserigen Geweben erfordert zusätzliche mechanische oder enzymatische Trennschritte ^2,3,4. Dieser Prozess wird in der Regel manuell durchgeführt, was ihn sehr zeitaufwändig und anfällig für Benutzerschwankungen bei der Beurteilung von Zellausbeuten und Probenviabilität macht. Daher ist es wichtig, anpassbare Optionen für die automatisierte Gewebedissoziation einzuführen. Es wurden zwar einige Versuche unternommen, solche Systeme zu entwickeln, aber die vorhandenen Optionen sind nicht immer leicht zugänglich, insbesondere in akademischen Labors und ressourcenärmeren Umgebungen, was vor allem auf die unerschwingliche Natur dieser Geräte zurückzuführen^{ist 5}. Darüber hinaus sind diese Geräte nicht immer an die individuellen Bedürfnisse einer Forschungsgruppe anpassbar⁶.

Hier wurde ein Gewebedissoziatorgerät entwickelt, um den Verdau ganzer Gewebe oder Gewebestücke in Einzelzellsuspensionen mit Hilfe von Verdauungsenzymen und mechanischem Aufschluss zu automatisieren. Dieses Gerät kann einfach im Labor zusammengebaut, zur Temperaturregulierung in Heiz- oder Kühlkammern platziert, an die erforderliche Anzahl von zu dissoziierenden Geweben angepasst und mit den gewünschten Dissoziationsprotokollen programmiert werden. Der breite Einsatz dieses Geräts könnte die Reproduzierbarkeit von Zellextraktionsprotokollen erheblich verbessern und eine zeitsparende Alternative zur manuellen Dissoziation bieten.

Das Design ermöglicht den gleichzeitigen Aufschluss von bis zu 12 Geweben durch einen automatisierten Prozess. Das Gerät besteht aus 12 einzelnen Motoren, die parallel geschaltet sind und über einen Standard-Wandstecker über einen AC/DC-Adapter mit einstellbarem Spannungsregler zur Steuerung der Rotation/Drehzahl der Motoren mit Strom versorgt werden. Die Motoren drehen eine Sechskantschraube, die genau in die Oberseite der C-Rohre passt. Die C-Rohre werden durch Abwärtsspannung auf einer Acrylplatte gehalten, die auf beiden Seiten an der oberen Platte einrastet, an der die Motoren befestigt sind (Abbildung 1B). Da die Motoren parallel verdrahtet sind, sollte ihre Drehzahl bei einer bestimmten Spannung nicht stark variieren, aber die Last (die Anzahl der am Gerät montierten C-Röhren) beeinflusst die Drehzahl, selbst wenn die Spannung konstant gehalten wird. Zur Messung der Umdrehungen pro Minute (U/min) wurde ein Drehzahlmesser mit einem Hall-Effekt-Sensor und einem festen Magneten auf einer der Motorwellen eingebaut (Ergänzende Abbildung 1). Die CAD-Dateien für den Bau von Motor-Arrays werden in der ergänzenden Codierungsdatei 1 bereitgestellt. Ebenfalls enthalten ist ein programmierbarer Schalter zur Umkehrung der Drehrichtung durch Umkehrung der an die Motoren abgegebenen positiven/negativen Ladungen. Alle diese Funktionen werden mithilfe einer codierten Software (Arduino IDE-Software, siehe Materialtabelle) auf einem Arduino Nano (Supplementary Coding File 2) integriert. Mit angeschlossenen Tasten und einem LCD-Panel (Ergänzende Abbildung 2) ist es möglich, gespeicherte und benutzerdefinierte Protokolle zu erstellen und auszuführen, die Drehrichtung zu bestimmten Zeiten eines Protokolls automatisch umzukehren, die Drehzahl anhand der Spannung anzupassen (Ergänzende Abbildung 3) und die aktuelle Motordrehzahl und die verbleibende Zeit anzuzeigen, um ein programmiertes Protokoll abzuschließen (Ergänzende Abbildung 4).

Für die vorliegende Studie wurden Einzelzellsuspensionen sowohl unter Verwendung mechanisch-enzymatischer Gewebedissoziation mit diesem Gerät als auch manuell-enzymatischer Gewebedissoziation hergestellt, um gegebenenfalls Unterschiede in Zellen zu bestimmen, die für nachgeschaltete Anwendungen gewonnen wurden. Die Zellpräparate wurden auf der Grundlage der Gesamtzellausbeute pro Gewebe und der prozentualen Zellviabilität bewertet. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um potenzielle Unterschiede in der Oberflächenmarkerexpression zu vergleichen. Die Daten wurden mit Hilfe von Grafik- und statistischer Analysesoftware analysiert. Unpaarige Welch-t-Tests wurden verwendet, um Paare von Proben oder Gruppen zu vergleichen, wobei die Stichprobengrößen n > 4 Mäusen 2 Wiederholungsexperimente darstellten. Detaillierte Anweisungen zur Herstellung und Montage dieses Geräts finden Sie in der Zusatzdatei 1. Die für dieses Protokoll benötigten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Für diese Studien wurden Gewebe von 7 bis 9 Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Mäusen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Manuelle Dissoziation

HINWEIS: Dieser Schritt wurde von Maisel K. et ^al.7 übernommen.

1. Entfernen Sie präpariertes Gewebe und legen Sie es in kalte Zellkulturmedien mit 5% fötalem Rinderserum (FBS).
2. Hacken Sie das Gewebe mit einer scharfen Sezierschere, bis die Fragmente in jeder Dimension kleiner als 1 mm sind.
3. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ml Medium hinzu.
4. Fügen Sie Verdauungsenzyme hinzu, die auf den zu isolierenden Gewebe- und Zelltypen basieren. Verwenden Sie für die vorgestellten Experimente Kollagenase 4 (1 mg/ml), Kollagenase D (1 mg/ml) und DNase (40 μg/ml).
5. Inkubieren Sie 1 h lang bei 37 °C auf einem Schüttler oder einer Wippe unter leichtem Rühren während der gesamten Inkubation. Pipettieren Sie die Probe 100 Mal auf und ab.
6. Fügen Sie EDTA hinzu, um ein Probenvolumen mit einer Konzentration von 5 mM zu erreichen. Pipettieren Sie die Probe 100 Mal auf und ab und pipettieren Sie die Probe dann 100 Mal kräftig auf und ab.
7. Die Probe wird durch ein 70-μm-Zellsieb geleitet und in einem 50-ml- oder 15-ml-Röhrchen gesammelt.
8. Die gesammelten Zellen werden bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen. 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren.
9. Neutralisieren Sie den Lysepuffer durch Zugabe von 9 ml kalter 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
10. Die gesammelten Zellen werden erneut bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen im gewünschten Puffer oder Medium.

2. Halbautomatische mechanische Dissoziation

1. Legen Sie das präparierte Gewebe in kalte Zellkulturmedien mit 5% fötalem Rinderserum (FBS).
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Zellisolierung aus festem Gewebe vorgesehen.
2. Hacken Sie das Gewebe mit einer scharfen Sezierschere, bis die Gewebefragmente etwa 5 mm groß sind. Übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein C-Röhrchen und fügen Sie 1 ml Medium hinzu.
3. Laden Sie das C-Rohr auf das Gerät. Montieren Sie die Rohrhalterplatte (Ergänzende Abbildung 1A) über den D-förmigen Rohrböden.
4. Befestigen Sie die Rohre an der Motorplatte, indem Sie die Spannarme in die Acrylplatte einrasten (Ergänzende Abbildung 3).
5. Stellen Sie ein benutzerdefiniertes Programm ein: Vorwärts, 30 s; Rückwärts, 10 s; Schleife, 4 Mal.
   1. Wählen Sie den benutzerdefinierten Modus aus dem Hauptmenü , indem Sie die blaue Taste drücken.
   2. Legen Sie im ersten Menü des benutzerdefinierten Modus die Dauer der Vorwärtsdrehung auf 30 s fest, indem Sie die rote Taste drücken, bis der Wert auf dem Bildschirm 30 s anzeigt. Drücken Sie die blaue Taste, um diesen Wert auszuwählen und zum nächsten Menübildschirm zu gelangen.
   3. Legen Sie im zweiten Menü für den benutzerdefinierten Modus die Dauer der Rückwärtsdrehung auf 10 s fest, indem Sie die rote Taste drücken, bis der Wert auf dem Bildschirm 10 s anzeigt. Drücken Sie die blaue Taste, um diesen Wert auszuwählen und zum nächsten Menübildschirm zu gelangen.
   4. Geben Sie im dritten Menü für den benutzerdefinierten Modus an, wie oft die in den Schritten 2.5.2 bis 2.5.3 festgelegten Auswahlen wiederholt werden sollen, indem Sie die rote Taste drücken, bis der Wert auf dem Bildschirm 4X lautet. Drücken Sie die blaue Taste, um diesen Wert auszuwählen und das Programm zu starten.
      HINWEIS: Benutzerdefinierte Programme werden nicht im Gerätespeicher gespeichert, können aber als eines der voreingestellten Programme für einen schnelleren Betrieb programmiert werden (Anweisungen zur Geräteprogrammierung finden Sie in der Zusatzdatei 1).
6. Führen Sie das benutzerdefinierte Programm mit 200 U/min aus, indem Sie den Spannungsregler einstellen (Ergänzende Abbildung 3), bis der berechnete Drehzahlwert in der unteren rechten Ecke des LCD-Bildschirms 200 anzeigt (Ergänzende Abbildung 4).
7. Fügen Sie Verdauungsenzyme in 4-ml-Medien entsprechend den zu isolierenden Gewebe- und Zelltypen hinzu.
   HINWEIS: Verwenden Sie für die vorgestellten Experimente Kollagenase 4 (1 mg/ml), Kollagenase D (1 mg/ml) und DNase (40 μg/ml).
8. Laden Sie das C-Rohr in das Gerät und wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.6, um das folgende Programm mit 200 U/min auszuführen: Vorwärts, 30 s; Rückwärts, 10 s; Schleife, 4 Mal.
9. Stellen Sie das Gerät mit den noch geladenen Röhrchen für 45 min in einen 37 °C Inkubator.
10. Laden Sie das C-Rohr in das Gerät und wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.6, um das folgende Programm mit 50 U/min auszuführen: Vorwärts, 270 s; Rückwärts, 30 s; Schleife, 9 Mal.
11. Fügen Sie EDTA hinzu, um eine Konzentration von 5 mM in der Probe zu erreichen.
12. Laden Sie das C-Rohr in das Gerät und wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.6, um das folgende Programm mit 100 U/min auszuführen: Vorwärts, 30 s; Rückwärts, 10 s; Schleife, 2 Mal.
13. Drücken Sie die Probe durch ein 70-μm-Zellsieb und sammeln Sie sie in einem 50-ml- oder 15-ml-Röhrchen.
14. Die gesammelten Zellen werden bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen. 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren.
15. Neutralisieren Sie den Lysepuffer mit 9 ml kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
16. Die gesammelten Zellen werden erneut bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen im gewünschten Puffer oder Medium.

3. Datenanalyse

1. Analysieren Sie die Daten mit einer Grafik- und Statistikanalysesoftware (siehe Materialtabelle).
2. Verwenden Sie ungepaarte Welch-t-Tests , um Paare von Proben oder Gruppen zu vergleichen, wobei die Stichprobengrößen n > 4 Mäusen 2 Replikationsexperimente darstellen.
   HINWEIS: Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn (p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Ergebnisse

Dieses halbautomatische mechanische Protokoll kann Ergebnisse von Experimenten replizieren, in denen Zellen manuell bearbeitet wurden. Zellsuspensionen, die mit diesem Gerät und durch manuelle Dissoziation hergestellt wurden, zeigen vergleichbare Zellausbeuten und Probenviabilität in Lungen-, Nieren- und Herzgeweben von Mäusen (Abbildung 2A, B). Populationen von Immunzellen, wie T-Zellen und dendritische Zellen, wurden durch einen Unterschied im Isolationsprotokoll nicht ...

Diskussion

Dieses Gerät wurde für die einfache Montage in der Forschungsumgebung entwickelt, um Einzelzellsuspensionen aus ganzen Geweben für die anschließende Einzelzellanalyse bereitzustellen. Die Funktionen sind zwar einfach, reichen aber aus, um die Bedürfnisse von Forschern im akademischen Umfeld und darüber hinaus zu erfüllen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Geräts ist sein Potenzial, die Herstellung von Einzelzellsuspensionen durch Verringerung der Variabilität zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Fähigkeit, ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3