Mechanische Dissoziation von Geweben für die Einzelzellanalyse mit einem motorisierten Gerät

Zusammenfassung

Es wird ein allgemeines Protokoll für die kombinierte enzymatische und halbautomatische mechanische Dissoziation von Geweben zur Erzeugung von Einzelzellsuspensionen für nachgeschaltete Analysen, wie z. B. die Durchflusszytometrie, bereitgestellt. Anweisungen für die Herstellung, Montage und den Betrieb der kostengünstigen mechanischen Vorrichtung, die für dieses Protokoll entwickelt wurde, sind enthalten.

Zusammenfassung

Die Möglichkeit, einzelne Zellen für die Analyse von Gewebeproben zu isolieren und vorzubereiten, ist für neue biomedizinische Entdeckungen und Forschungen schnell entscheidend geworden. Manuelle Protokolle für Einzelzellisolierungen sind sehr zeitaufwändig und anfällig für Benutzervariabilität. Automatisierte mechanische Protokolle sind in der Lage, die Verarbeitungszeit und die Probenvariabilität zu reduzieren, sind aber in Forschungsumgebungen mit geringeren Ressourcen nicht leicht zugänglich oder kostengünstig. Das hier beschriebene Gerät wurde für die halbautomatische Gewebedissoziation unter Verwendung kommerziell erhältlicher Materialien als kostengünstige Alternative für akademische Labore entwickelt. Anweisungen zur Herstellung, Montage und Bedienung des Gerätedesigns wurden bereitgestellt. Das Dissoziationsprotokoll erzeugt zuverlässig Einzelzellsuspensionen mit vergleichbaren Zellausbeuten und Probenviabilität wie manuelle Präparationen über mehrere Mausgewebe. Das Protokoll bietet die Möglichkeit, bis zu 12 Gewebeproben gleichzeitig pro Gerät zu verarbeiten, wodurch Studien, die große Probengrößen erfordern, leichter zu bewältigen sind. Die mitgelieferte Software ermöglicht auch die Anpassung des Geräteprotokolls, um unterschiedliche Gewebe und experimentelle Einschränkungen zu berücksichtigen.

Einleitung

Die Einzelzellanalyse ist für neue biomedizinische Entdeckungen schnell von entscheidender Bedeutung geworden, sei es für Anwendungen wie die Durchflusszytometrie, die Identifizierung verschiedener Zelltypen, die Einzelzellsequenzierung oder die Identifizierung genomischer oder transkriptomischer Variationen zwischen Zellen¹. Die Durchführung solcher Zellisolierungen aus Geweben von Interesse erfordert das Zerkleinern von präpariertem Gewebe und das Schieben durch ein feines Zellsieb, um das Bindegewebe aus den gewünschten Zellen herauszufiltern (Abbildung 1A). Die Isolierung adhärenter Zelltypen, wie dendritische ....

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Für diese Studien wurden Gewebe von 7 bis 9 Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Mäusen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Manuelle Dissoziation

HINWEIS: Dieser Schritt wurde von Maisel K. et ^al.7 übernommen.

1. Entfernen Sie präpariertes Gewebe und legen Sie es in kalte Zellkulturmedien mit 5% fötalem Rinderserum (FBS).
2. Hacken Sie das Gewebe mit einer scharfen Sezierschere, bis die Fragmente....

Ergebnisse

Dieses halbautomatische mechanische Protokoll kann Ergebnisse von Experimenten replizieren, in denen Zellen manuell bearbeitet wurden. Zellsuspensionen, die mit diesem Gerät und durch manuelle Dissoziation hergestellt wurden, zeigen vergleichbare Zellausbeuten und Probenviabilität in Lungen-, Nieren- und Herzgeweben von Mäusen (Abbildung 2A, B). Populationen von Immunzellen, wie T-Zellen und dendritische Zellen, wurden durch einen Unterschied im Isolationsprotokoll nicht .......

Diskussion

Dieses Gerät wurde für die einfache Montage in der Forschungsumgebung entwickelt, um Einzelzellsuspensionen aus ganzen Geweben für die anschließende Einzelzellanalyse bereitzustellen. Die Funktionen sind zwar einfach, reichen aber aus, um die Bedürfnisse von Forschern im akademischen Umfeld und darüber hinaus zu erfüllen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Geräts ist sein Potenzial, die Herstellung von Einzelzellsuspensionen durch Verringerung der Variabilität zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Fähigkeit, .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3