Dissociation mécanique de tissus pour l’analyse de cellules uniques à l’aide d’un dispositif motorisé

Résumé

Un protocole général pour la dissociation mécanique enzymatique et semi-automatisée combinée des tissus afin de générer des suspensions unicellulaires pour des analyses en aval, telles que la cytométrie en flux, est fourni. Des instructions pour la fabrication, l’assemblage et le fonctionnement du dispositif mécanique à faible coût développé pour ce protocole sont incluses.

Résumé

Être capable d’isoler et de préparer des cellules uniques pour l’analyse d’échantillons de tissus est rapidement devenu crucial pour les nouvelles découvertes et recherches biomédicales. Les protocoles manuels pour les isolements de cellules uniques prennent beaucoup de temps et sont sujets à la variabilité de l’utilisateur. Les protocoles mécaniques automatisés sont capables de réduire le temps de traitement et la variabilité des échantillons, mais ne sont pas facilement accessibles ou rentables dans les milieux de recherche à faibles ressources. Le dispositif décrit ici a été conçu pour la dissociation semi-automatisée des tissus en utilisant des matériaux disponibles dans le commerce comme alternative peu coûteuse pour les laboratoires universitaires. Des instructions pour fabriquer, assembler et utiliser la conception de l’appareil ont été fournies. Le protocole de dissociation produit de manière fiable des suspensions unicellulaires avec des rendements cellulaires et une viabilité d’échantillon comparables à ceux des préparations manuelles sur plusieurs tissus de souris. Le protocole offre la possibilité de traiter jusqu’à 12 échantillons de tissus simultanément par dispositif, ce qui facilite la gestion des études nécessitant des échantillons de grande taille. Le logiciel qui l’accompagne permet également de personnaliser le protocole du dispositif pour s’adapter à divers tissus et contraintes expérimentales.

Introduction

L’analyse de cellules uniques est rapidement devenue cruciale pour les nouvelles découvertes biomédicales, que ce soit pour des applications telles que la cytométrie en flux, l’identification de différents types de cellules, le séquençage de cellules uniques ou pour l’identification de variations génomiques ou transcriptomiques entre les cellules¹. Pour effectuer de tels isolements cellulaires à partir de tissus d’intérêt, il faut hacher des tissus disséqués et les pousser à travers une fine passoire cellulaire pour filtrer le tissu conjonctif des cellules souhaitées (Figure 1A). L’isolement des types de cellules adhérentes, telles que les cellules dendritiques ou les macrophages, ou les cellules de tissus particulièrement fibreux, nécessite des étapes de séparation mécaniques ou enzymatiques supplémentaires ^2,3,4. Ce processus est généralement effectué manuellement, ce qui le rend très long et sujet à la variabilité de l’utilisateur lors de l’évaluation des rendements cellulaires et de la viabilité des échantillons. Par conséquent, il est crucial d’introduire des options personnalisables pour la dissociation tissulaire automatisée. Bien que certaines tentatives aient été faites pour concevoir de tels systèmes, les options existantes ne sont pas toujours facilement accessibles, en particulier dans les laboratoires universitaires et les milieux à faibles ressources, en grande partie en raison de la nature prohibitive de ces dispositifs⁵. De plus, ces appareils ne sont pas toujours personnalisables en fonction des besoins individuels d’un groupe de recherche⁶.

Ici, un dispositif de dissociation tissulaire a été conçu pour automatiser la digestion de tissus entiers ou de morceaux de tissus en suspensions unicellulaires à l’aide d’enzymes digestives et de perturbations mécaniques. Cet appareil peut être facilement assemblé en laboratoire, placé dans des chambres de chauffage ou de refroidissement pour la régulation de la température, personnalisé pour le nombre requis de tissus à dissocier et programmé avec les protocoles de dissociation souhaités. L’utilisation généralisée de ce dispositif pourrait améliorer considérablement la reproductibilité des protocoles d’extraction cellulaire et fournir une alternative rapide à la dissociation manuelle.

La conception permet la digestion simultanée de jusqu’à 12 tissus grâce à un processus automatisé. L’appareil est composé de 12 moteurs individuels câblés en parallèle et alimentés par une prise murale standard via un adaptateur AC/DC avec un cadran de tension réglable pour contrôler la rotation/vitesse des moteurs. Les moteurs font tourner un boulon hexagonal qui s’insère parfaitement dans le haut des tubes en C. Les tubes C sont maintenus en place par une tension vers le bas sur une plaque acrylique qui se verrouille de chaque côté à la plaque supérieure où les moteurs sont fixés (Figure 1B). Parce que les moteurs sont câblés en parallèle, leur vitesse à une tension donnée ne devrait pas varier beaucoup, mais la charge (le nombre de tubes C montés sur l’appareil) affectera la vitesse même lorsque la tension est maintenue constante. Pour mesurer les rotations par minute (tr/min), un tachymètre a été incorporé à l’aide d’un capteur à effet Hall et d’un aimant fixe sur l’un des arbres du moteur (Figure supplémentaire 1). Les fichiers CAO pour la construction de réseaux de moteurs sont fournis dans le fichier de codage supplémentaire 1. Un interrupteur programmable est également inclus pour inverser le sens de rotation en inversant les charges positives/négatives délivrées aux moteurs. Toutes ces fonctionnalités sont intégrées à l’aide d’un logiciel codé (logiciel Arduino IDE, voir Table des matériaux) sur un Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). À l’aide de boutons connectés et d’un écran LCD (Figure supplémentaire 2), il est possible de créer et d’exécuter des protocoles enregistrés et personnalisés, d’inverser automatiquement le sens de rotation à des moments spécifiés d’un protocole, d’ajuster la vitesse à l’aide de la tension (Figure supplémentaire 3) et d’afficher la vitesse actuelle du moteur et le temps restant pour terminer un protocole programmé (Figure supplémentaire 4).

Pour la présente étude, des suspensions unicellulaires ont été préparées en utilisant à la fois la dissociation tissulaire mécanique-enzymatique avec ce dispositif et la dissociation tissulaire-enzymatique manuelle pour déterminer les différences, le cas échéant, dans les cellules récupérées pour des applications en aval. Les préparations cellulaires ont été évaluées en fonction du rendement total des cellules par tissu et du pourcentage de viabilité cellulaire. La cytométrie en flux a été utilisée pour comparer les différences potentielles dans l’expression des marqueurs de surface. Les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel de graphisme et d’analyse statistique. Des tests t de Welch non appariés ont été utilisés pour comparer des paires d’échantillons ou de groupes, avec des tailles d’échantillon n > 4 souris représentant 2 expériences répétées. Des instructions détaillées pour la fabrication et l’assemblage de cet appareil se trouvent dans le dossier supplémentaire 1. Le matériel nécessaire à ce protocole est indiqué dans le tableau des matériaux.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’UMD (IACUC). Des tissus de souris C57BL/6J femelles âgées de 7 à 9 semaines ont été utilisés pour ces études. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Dissociation manuelle

NOTE : Cette étape est adaptée de Maisel K. et ^al.7.

1. Retirez le tissu disséqué et placez-le dans un milieu de culture cellulaire froid avec 5 % de sérum de veau fœtal (FBS).
2. Hachez le tissu à l’aide de ciseaux de dissection tranchants jusqu’à ce que les fragments soient inférieurs à 1 mm dans n’importe quelle dimension.
3. Transférer le mouchoir haché dans un tube conique de 15 mL et ajouter 5 mL de milieu.
4. Ajoutez des enzymes de digestion en fonction des types de tissus et de cellules isolés. Pour les expériences présentées, utilisez la collagénase 4 (1 mg/mL), la collagénase D (1 mg/mL) et la DNase (40 μg/mL).
5. Incuber sur un agitateur ou une bascule pendant 1 h à 37 °C en agitant doucement tout au long de l’incubation. Pipeter l’échantillon de haut en bas 100 fois.
6. Ajouter de l’EDTA pour obtenir un volume d’échantillon avec une concentration de 5 mM. Pipeter l’échantillon de haut en bas 100 fois, puis pipeter vigoureusement l’échantillon de haut en bas 100 fois.
7. Passer l’échantillon dans une crépine de 70 μm et le prélever dans un tube de 50 ml ou 15 ml.
8. Centrifuger les cellules collectées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges. Incuber 1 min à température ambiante.
9. Neutraliser le tampon de lyse en ajoutant 9 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X froide.
10. Centrifuger à nouveau les cellules collectées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez les cellules en suspension dans le tampon ou le milieu souhaité.

2. Dissociation mécanique semi-automatisée

1. Placer le tissu disséqué dans un milieu de culture à cellules froides avec 5 % de sérum fœtal bovin (FBS).
   REMARQUE : Ce protocole est destiné à l’isolement cellulaire des tissus solides.
2. Hachez le tissu à l’aide de ciseaux de dissection tranchants jusqu’à ce que les fragments de tissu mesurent environ 5 mm dans n’importe quelle dimension. Transférer le tissu haché dans un tube C et ajouter 1 mL de milieu.
3. Chargez le tube C sur l’appareil. Placez la plaque porte-tube (Figure supplémentaire 1A) sur le fond du tube en forme de D.
4. Fixez les tubes à la plaque du moteur en verrouillant les bras de tension dans la plaque acrylique (Figure supplémentaire 3).
5. Définir un programme personnalisé : Avant, 30 s ; Revers de 10 s ; Boucle, 4 fois.
   1. Choisissez le mode personnalisé dans le menu principal en appuyant sur le bouton bleu .
   2. Dans le premier menu du mode personnalisé, spécifiez la durée de la rotation vers l’avant à 30 s en appuyant sur le bouton rouge jusqu’à ce que la valeur à l’écran indique 30 s. Appuyez sur le bouton bleu pour sélectionner cette valeur et passer à l’écran de menu suivant.
   3. Dans le deuxième menu du mode personnalisé, spécifiez la durée de la rotation inverse à 10 s en appuyant sur le bouton rouge jusqu’à ce que la valeur à l’écran indique 10 s. Appuyez sur le bouton bleu pour sélectionner cette valeur et passer à l’écran de menu suivant.
   4. Dans le troisième menu du mode personnalisé, spécifiez le nombre de fois qu’il faut répéter les sélections définies aux étapes 2.5.2-2.5.3 en appuyant sur le bouton rouge jusqu’à ce que la valeur à l’écran indique 4X. Appuyez sur le bouton bleu pour sélectionner cette valeur et démarrer le programme.
      REMARQUE : Les programmes personnalisés ne sont pas stockés dans la mémoire de l’appareil mais peuvent être programmés comme l’un des programmes prédéfinis pour un fonctionnement plus rapide (les instructions de programmation de l’appareil sont fournies dans le fichier supplémentaire 1).
6. Exécutez le programme personnalisé à 200 tr/min en ajustant la molette de commande de tension (Figure supplémentaire 3) jusqu’à ce que la valeur de régime calculée dans le coin inférieur droit de l’écran LCD indique 200 (Figure supplémentaire 4).
7. Ajouter les enzymes de digestion dans un milieu de 4 mL selon les types de tissus et de cellules isolés.
   REMARQUE : Pour les expériences présentées, utiliser la collagénase 4 (1 mg/mL), la collagénase D (1 mg/mL) et la DNase (40 μg/mL).
8. Chargez le tube C sur l’appareil et répétez les étapes 2.3-2.6 pour exécuter le programme suivant à 200 tr/min : Avant, 30 s ; Revers de 10 s ; Boucle, 4 fois.
9. Transférez l’appareil avec les tubes encore chargés dans un incubateur à 37 °C pendant 45 min.
10. Chargez le tube C sur l’appareil et répétez les étapes 2.3-2.6 pour exécuter le programme suivant à 50 tr/min : Avant, 270 s ; revers, 30 s ; Boucle, 9 fois.
11. Ajouter de l’EDTA pour obtenir une concentration de 5 mM dans l’échantillon.
12. Chargez le tube C sur l’appareil et répétez les étapes 2.3-2.6 pour exécuter le programme suivant à 100 tr/min : Avant, 30 s ; Revers de 10 s ; Boucle, 2 fois.
13. Poussez l’échantillon à travers une crépine de 70 μm et prélevez-le dans un tube de 50 ml ou 15 ml.
14. Centrifuger les cellules collectées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges. Incuber 1 min à température ambiante.
15. Neutraliser le tampon de lyse avec 9 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide.
16. Centrifuger à nouveau les cellules collectées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez les cellules en suspension dans le tampon ou le milieu souhaité.

3. Analyse des données

1. Analyser les données à l’aide d’un logiciel de graphiques et d’analyses statistiques (voir Tableau des matériaux).
2. Utilisez des tests t de Welch non appariés pour comparer des paires d’échantillons ou de groupes, avec des tailles d’échantillon n > 4 souris représentant 2 expériences répétées.
   REMARQUE : Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives lorsque (p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Résultats

Ce protocole mécanique semi-automatisé peut reproduire les résultats d’expériences dans lesquelles les cellules ont été traitées manuellement. Les suspensions cellulaires préparées à l’aide de ce dispositif et par dissociation manuelle montrent des rendements cellulaires et une viabilité d’échantillon comparables dans les tissus pulmonaires, rénaux et cardiaques de souris (Figure 2A,B). Les populations de cellules immunitaires, telles que les lymphocytes T...

Discussion

Ce dispositif a été conçu pour être facilement assemblé dans le cadre de la recherche afin de fournir des suspensions unicellulaires à partir de tissus entiers pour une analyse ultérieure sur cellule unique. Les fonctionnalités, bien que basiques, sont suffisantes pour répondre aux besoins des chercheurs en milieu universitaire et au-delà. L’un des principaux avantages de l’utilisation de ce dispositif est son potentiel d’amélioration de la préparation des suspensions unicellulaires en réduisant la var...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3