Dissociazione meccanica dei tessuti per l'analisi di singole cellule mediante dispositivo motorizzato

Riepilogo

Viene fornito un protocollo generale per la dissociazione meccanica enzimatica e semiautomatica combinata dei tessuti per generare sospensioni a singola cellula per analisi a valle, come la citometria a flusso. Sono incluse le istruzioni per la fabbricazione, l'assemblaggio e il funzionamento del dispositivo meccanico a basso costo sviluppato per questo protocollo.

Abstract

Essere in grado di isolare e preparare singole cellule per l'analisi di campioni di tessuto è diventato rapidamente cruciale per le nuove scoperte e ricerche biomediche. I protocolli manuali per gli isolamenti a singola cellula sono molto dispendiosi in termini di tempo e soggetti a variabilità dell'utente. I protocolli meccanici automatizzati sono in grado di ridurre i tempi di elaborazione e la variabilità dei campioni, ma non sono facilmente accessibili o convenienti in contesti di ricerca con risorse ridotte. Il dispositivo qui descritto è stato progettato per la dissociazione semiautomatica dei tessuti utilizzando materiali disponibili in commercio come alternativa a basso costo per i laboratori accademici. Sono state fornite le istruzioni per fabbricare, assemblare e utilizzare il design del dispositivo. Il protocollo di dissociazione produce in modo affidabile sospensioni a singola cellula con rese cellulari e vitalità del campione paragonabili alle preparazioni manuali su più tessuti di topo. Il protocollo offre la possibilità di elaborare fino a 12 campioni di tessuto contemporaneamente per dispositivo, rendendo più gestibili gli studi che richiedono campioni di grandi dimensioni. Il software di accompagnamento consente inoltre di personalizzare il protocollo del dispositivo per adattarsi ai diversi tessuti e vincoli sperimentali.

Introduzione

L'analisi di singole cellule è diventata rapidamente cruciale per le nuove scoperte biomediche, sia per applicazioni come la citometria a flusso, l'identificazione di diversi tipi di cellule, il sequenziamento di singole cellule o per l'identificazione di variazioni genomiche o trascrittomiche tra le cellule¹. L'esecuzione di tali isolamenti cellulari dai tessuti di interesse richiede la triturazione dei tessuti sezionati e la loro spinta attraverso un filtro cellulare fine per filtrare il tessuto connettivo dalle cellule desiderate (Figura 1A). L'isolamento di tipi di cellule aderenti, come le cellule dendritiche o i macrofagi, o di cellule provenienti da tessuti particolarmente fibrosi, richiede ulteriori passaggi di separazione meccanica o enzimatica ^2,3,4. Questo processo viene generalmente eseguito manualmente, il che lo rende molto dispendioso in termini di tempo e soggetto a variabilità dell'utente quando si valutano le rese cellulari e la vitalità del campione. Pertanto, è fondamentale introdurre opzioni personalizzabili per la dissociazione automatizzata dei tessuti. Sebbene siano stati fatti alcuni tentativi per progettare tali sistemi, le opzioni esistenti non sono sempre facilmente accessibili, in particolare nei laboratori accademici e in ambienti con risorse ridotte, in gran parte a causa della natura proibitiva dei costi di questi dispositivi⁵. Inoltre, questi dispositivi non sono sempre personalizzabili in base alle esigenze individuali di un gruppo di ricerca⁶.

Qui, un dispositivo di dissociazione tissutale è stato progettato per automatizzare la digestione di interi tessuti o pezzi di tessuto in sospensioni unicellulari con l'aiuto di enzimi digestivi e interruzioni meccaniche. Questo dispositivo può essere facilmente assemblato in laboratorio, collocato in camere di riscaldamento o raffreddamento per la regolazione della temperatura, personalizzato per il numero richiesto di tessuti da dissociare e programmato con i protocolli di dissociazione desiderati. L'ampio uso di questo dispositivo potrebbe migliorare significativamente la riproducibilità dei protocolli di estrazione cellulare e fornire un'alternativa che consente di risparmiare tempo alla dissociazione manuale.

Il design consente la digestione simultanea di un massimo di 12 tessuti attraverso un processo automatizzato. Il dispositivo è composto da 12 singoli motori cablati in parallelo e alimentati da una presa a muro standard tramite un adattatore AC/DC con un quadrante di tensione regolabile per controllare la rotazione/velocità dei motori. I motori ruotano un bullone esagonale che si inserisce perfettamente nella parte superiore dei tubi a C. I tubi a C sono tenuti in posizione da una tensione verso il basso su una piastra acrilica che si aggancia su entrambi i lati alla piastra superiore dove sono fissati i motori (Figura 1B). Poiché i motori sono cablati in parallelo, la loro velocità a una data tensione non dovrebbe variare molto, ma il carico (il numero di tubi a C montati sul dispositivo) influenzerà la velocità anche quando la tensione viene mantenuta costante. Per misurare le rotazioni al minuto (giri/min), è stato incorporato un tachimetro che utilizza un sensore ad effetto Hall e un magnete fisso su uno degli alberi motore (Figura 1 supplementare). I file CAD per la costruzione di array di motori sono forniti nel file di codifica supplementare 1. È incluso anche un interruttore programmabile per invertire il senso di rotazione invertendo le cariche positive/negative erogate ai motori. Tutte queste funzionalità sono integrate utilizzando un software codificato (software Arduino IDE, vedi Table of Materials) su un Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Utilizzando i pulsanti collegati e un pannello LCD (Figura supplementare 2), è possibile creare ed eseguire protocolli salvati e personalizzati, invertire automaticamente il senso di rotazione a orari specificati di un protocollo, regolare la velocità utilizzando la tensione (Figura supplementare 3) e visualizzare la velocità corrente del motore e il tempo rimanente per completare un protocollo programmato (Figura supplementare 4).

Per il presente studio, sono state preparate sospensioni a singola cellula utilizzando sia la dissociazione tissutale meccanico-enzimatica con questo dispositivo che la dissociazione tissutale manuale-enzimatica per determinare le differenze, se presenti, nelle cellule recuperate per applicazioni a valle. Le preparazioni cellulari sono state valutate in base alla resa cellulare totale per tessuto e alla percentuale di vitalità cellulare. La citometria a flusso è stata utilizzata per confrontare le differenze di potenziale nell'espressione dei marcatori di superficie. I dati sono stati analizzati utilizzando software di analisi grafica e statistica. I t-test Welch non accoppiati sono stati utilizzati per confrontare coppie di campioni o gruppi, con dimensioni del campione n > 4 topi che rappresentavano 2 esperimenti replicati. Istruzioni dettagliate per la fabbricazione e il montaggio di questo dispositivo sono disponibili nel file supplementare 1. I materiali necessari per questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dall'UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per questi studi sono stati utilizzati tessuti di topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 7 e 9 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Dissociazione manuale

NOTA: Questo passaggio è adattato da Maisel K. et ^al.7.

1. Rimuovere il tessuto sezionato e metterlo in terreno di coltura cellulare freddo con il 5% di siero fetale bovino (FBS).
2. Tritare il tessuto usando forbici da dissezione affilate fino a quando i frammenti non sono più piccoli di 1 mm in qualsiasi dimensione.
3. Trasferire il tessuto tritato in una provetta conica da 15 mL e aggiungere 5 mL di terreno.
4. Aggiungere enzimi di digestione in base ai tipi di tessuto e cellule da isolare. Per gli esperimenti presentati, utilizzare la collagenasi 4 (1 mg/ml), la collagenasi D (1 mg/ml) e la DNasi (40 μg/ml).
5. Incubare su agitatore o bilanciere per 1 ora a 37 °C agitando delicatamente per tutta la durata dell'incubazione. Pipettare il campione su e giù 100 volte.
6. Aggiungere EDTA per ottenere un volume di campione con una concentrazione di 5 mM. Pipettare il campione su e giù 100 volte, quindi pipettare vigorosamente il campione su e giù 100 volte.
7. Passare il campione attraverso un colino cellulare da 70 μm e raccoglierlo in una provetta da 50 mL o 15 mL.
8. Centrifugare le cellule raccolte a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
9. Neutralizzare il tampone di lisi aggiungendo 9 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1X fredda (PBS).
10. Centrifugare nuovamente le cellule raccolte a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere le cellule nel tampone o nel terreno desiderato.

2. Dissociazione meccanica semiautomatica

1. Mettere il tessuto sezionato in terreni di coltura cellulare freddi con siero fetale bovino al 5% (FBS).
   NOTA: Questo protocollo è destinato all'isolamento cellulare da tessuti solidi.
2. Tritare il tessuto utilizzando forbici da dissezione affilate fino a quando i frammenti di tessuto non sono di circa 5 mm in qualsiasi dimensione. Trasferire il tessuto tritato in un tubo a C e aggiungere 1 ml di terreno.
3. Caricare il tubo a C sul dispositivo. Montare la piastra portatubo (Figura supplementare 1A) sui fondi dei tubi a forma di D.
4. Fissare i tubi alla piastra del motore bloccando i bracci di tensione nella piastra acrilica (Figura supplementare 3).
5. Impostare un programma personalizzato: Avanti, 30 s; Rovescio, 10 s; Loop, 4 volte.
   1. Scegli la modalità personalizzata dal menu principale premendo il pulsante blu .
   2. Nel primo menu della modalità personalizzata, specificare la durata della rotazione in avanti a 30 s premendo il pulsante rosso fino a quando il valore sullo schermo non indica 30 s. Premere il pulsante blu per selezionare questo valore e passare alla schermata del menu successiva.
   3. Nel secondo menu della modalità personalizzata, specificare la durata della rotazione inversa a 10 s premendo il pulsante rosso fino a quando il valore sullo schermo non indica 10 s. Premere il pulsante blu per selezionare questo valore e passare alla schermata del menu successiva.
   4. Nel terzo menu della modalità personalizzata, specificare il numero di volte in cui ripetere le selezioni impostate nei passaggi 2.5.2-2.5.3 premendo il pulsante rosso fino a quando il valore sullo schermo non indica 4X. Premere il pulsante blu per selezionare questo valore e avviare il programma.
      NOTA: I programmi personalizzati non vengono memorizzati nella memoria del dispositivo, ma possono essere programmati come uno dei programmi preimpostati per un funzionamento più rapido (le istruzioni di programmazione del dispositivo sono fornite nel file supplementare 1).
6. Eseguire il programma personalizzato a 200 giri/min regolando la manopola di controllo della tensione (Figura supplementare 3) fino a quando il valore di giri/min calcolato nell'angolo in basso a destra dello schermo LCD non indica 200 (Figura 4 supplementare).
7. Aggiungere gli enzimi di digestione in terreni da 4 mL in base ai tipi di tessuto e cellule da isolare.
   NOTA: Per gli esperimenti presentati, utilizzare la collagenasi 4 (1 mg/ml), la collagenasi D (1 mg/ml) e la DNasi (40 μg/ml).
8. Caricare il tubo a C sul dispositivo e ripetere i passaggi 2.3-2.6 per eseguire il seguente programma a 200 giri/min: Avanti, 30 s; Rovescio, 10 s; Loop, 4 volte.
9. Trasferire il dispositivo con le provette ancora caricate in un incubatore a 37 °C per 45 min.
10. Caricare il tubo a C sul dispositivo e ripetere i passaggi 2.3-2.6 per eseguire il seguente programma a 50 giri/min: Avanti, 270 s; Rovescio, 30 s; Loop, 9 volte.
11. Aggiungere EDTA per ottenere una concentrazione di 5 mM nel campione.
12. Caricare il tubo a C sul dispositivo e ripetere i passaggi 2.3-2.6 per eseguire il seguente programma a 100 giri/min: Avanti, 30 s; Rovescio, 10 s; Loop, 2 volte.
13. Spingere il campione attraverso un colino cellulare da 70 μm e raccoglierlo in una provetta da 50 mL o 15 mL.
14. Centrifugare le cellule raccolte a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
15. Neutralizzare il tampone di lisi con 9 mL di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS).
16. Centrifugare nuovamente le cellule raccolte a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere le cellule nel tampone o nel terreno desiderato.

3. Analisi dei dati

1. Analizzare i dati utilizzando un software di analisi grafica e statistica (vedi Tabella dei Materiali).
2. Utilizzare i test t Welch non appaiati per confrontare coppie di campioni o gruppi, con dimensioni del campione n > 4 topi che rappresentano 2 esperimenti replicati.
   NOTA: Le differenze sono state considerate statisticamente significative quando (p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

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Risultati

Questo protocollo meccanico semi-automatizzato è in grado di replicare i risultati di esperimenti in cui le cellule sono state elaborate manualmente. Le sospensioni cellulari preparate utilizzando questo dispositivo e mediante dissociazione manuale mostrano rese cellulari comparabili e vitalità del campione nei tessuti polmonari, renali e cardiaci del topo (Figura 2A,B). Le popolazioni di cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule dendritiche, non sono state signi...

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Discussione

Questo dispositivo è stato progettato per un facile assemblaggio in ambito di ricerca per fornire sospensioni unicellulari da tessuti interi per la successiva analisi di singole cellule. Le caratteristiche, sebbene di base, sono sufficienti per soddisfare le esigenze dei ricercatori in ambito accademico e non solo. Un vantaggio chiave dell'utilizzo di questo dispositivo è il suo potenziale per migliorare la preparazione di sospensioni a singola cellula riducendo la variabilità. Inoltre, la capacità di elaborare 12+ c...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3