使用电动设备对组织进行机械解离以进行单细胞分析

摘要

提供了组织结合酶法和半自动机械解离以产生用于下游分析（例如流式细胞术）的单细胞悬浮液的通用方案。包括为该协议开发的低成本机械装置的制造、组装和操作说明。

摘要

能够分离和制备用于分析组织样本的单细胞对于新的生物医学发现和研究迅速变得至关重要。单细胞分离的手动方案非常耗时，并且容易出现用户差异。自动化机械方案能够减少处理时间和样品变异性，但在资源匮乏的研究环境中不容易获得或具有成本效益。这里描述的设备是为使用市售材料进行半自动组织解离而设计的，作为学术实验室的低成本替代品。提供了制造、组装和操作设备设计的说明。该解离方案可靠地产生单细胞悬浮液，其细胞产量和样品活力与跨多个小鼠组织的手动制备相当。该方案能够为每台设备同时处理多达 12 个组织样本，使需要大样本量的研究更易于管理。随附的软件还允许自定义设备协议，以适应不同的组织和实验限制。

引言

无论是流式细胞术、识别不同细胞类型、单细胞测序，还是用于识别细胞之间的基因组或转录组变异，单细胞分析都已迅速成为新的生物医学发现的关键¹。从感兴趣的组织中进行这种细胞分离需要切碎解剖的组织并将它们推入细细胞过滤器，以从所需细胞中过滤掉结缔组织（图1A）。分离贴壁细胞类型，例如树突状细胞或巨噬细胞，或来自特定纤维组织的细胞，需要额外的机械或酶分离步骤^2,3,4。该过程通常是手动完成的，因此在评估细胞产量和样品活力时非常耗时且容易出现用户差异。因此，引入可定制的自动组织解离选项至关重要。虽然已经对设计此类系统进行了一些尝试，但现有的选项并不总是容易获得，特别是在学术实验室和资源匮乏的环境中，这主要是由于这些设备的成本过高⁵.此外，这些设备并不总是可以根据研究小组的个性化需求^{进行定制 6}.

在这里，设计了一种组织解离装置，用于在消化酶和机械破坏的帮助下将整个组织或组织块自动消化成单细胞悬浮液。该设备可以在实验室中轻松组装，放入加热或冷却室中进行温度调节，根据所需数量的解离组织进行定制，并使用所需的....

研究方案

该协议已获得UMD机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。这些研究使用了 7 至 9 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠的组织。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1.手动解离

注意：此步骤改编自 Maisel K. 等人 ⁷。

1. 取出解剖的组织并将其置于含有5%胎牛血清（FBS）的冷细胞培养基中。
2. 使用锋利的解剖剪刀切碎组织，直到碎片在任何尺寸上都小于 1 毫米。
3. 将切碎的组织转移到 15 mL 锥形管中，并加入 5 mL 培养基。
4. 根据分离的组织和细胞类型添加消化酶。对于所提出的实验，使用胶原酶 4 （1 mg/mL）、胶原酶 D （1 mg/mL） 和 DNase （40 μg/mL）。
5. 在37°C下在振荡器或摇杆上孵育1小时，在整个孵育过程中轻轻搅拌。上下移液100次。
6. 加入EDTA以达到5mM浓度的样品体积。上下移液100次，然后用力上下移液100次。
7. 将样品通过 70 μm 细胞过滤器，并将其收集在 50 mL 或 15 mL 管中。
8. 将收集的细胞在4°C下以300× g 离心5分钟。 使用移液管除去上清液，并....

讨论

该设备设计用于在研究环境中轻松组装，以提供来自整个组织的单细胞悬浮液，用于随后的单细胞分析。这些功能虽然很基本，但足以满足学术环境及其他环境中的研究人员的需求。使用该装置的一个主要优点是它有可能通过减少变异性来改进单细胞悬浮液的制备。此外，同时处理 12+ 个样品的能力可以提高样品间的一致性，这可能会受到手动解离方案所需时间增加的影响。在研究机构和行业环?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3