דיסוציאציה מכנית של רקמות לאנליזה של תא בודד באמצעות מכשיר ממונע

Summary

פרוטוקול כללי לדיסוציאציה מכנית אנזימטית ואוטומטית למחצה של רקמות ליצירת מתלים חד-תאיים לאנליזות במורד הזרם, כגון ציטומטריית זרימה, מסופק. הוראות לייצור, הרכבה ותפעול של המכשיר המכני בעלות נמוכה שפותח עבור פרוטוקול זה כלולות.

Abstract

היכולת לבודד ולהכין תאים בודדים לניתוח דגימות רקמה הפכה במהירות לחיונית לתגליות ומחקרים ביו-רפואיים חדשים. פרוטוקולים ידניים לבידודים של תא בודד גוזלים זמן רב ומועדים לשונות המשתמש. פרוטוקולים מכניים אוטומטיים מסוגלים להפחית את זמן העיבוד ואת השתנות הדגימה, אך אינם נגישים בקלות או חסכוניים בסביבות מחקר בעלות משאבים נמוכים יותר. המכשיר המתואר כאן תוכנן לדיסוציאציה חצי-אוטומטית של רקמות תוך שימוש בחומרים זמינים מסחרית כחלופה זולה למעבדות אקדמיות. הוראות לייצר, להרכיב ולהפעיל את עיצוב המכשיר סופקו. פרוטוקול הדיסוציאציה מייצר באופן אמין מתלים חד-תאיים עם תפוקת תאים דומה וכדימות דגימה להכנות ידניות על פני רקמות עכבר מרובות. הפרוטוקול מספק את היכולת לעבד עד 12 דגימות רקמה בו זמנית לכל מכשיר, מה שהופך מחקרים הדורשים דגימות גדולות לקלים יותר לניהול. התוכנה הנלווית מאפשרת גם התאמה אישית של פרוטוקול המכשיר כדי להתאים לרקמות משתנות ואילוצים ניסיוניים.

Introduction

אנליזה של תא בודד הפכה במהירות לחיונית לתגליות ביו-רפואיות חדשות, בין אם עבור יישומים כגון ציטומטריית זרימה, זיהוי סוגי תאים שונים, ריצוף תא בודד, או לזיהוי שינויים גנומיים או שעתוק בין תאים¹. ביצוע בידוד תאים כזה מרקמות מעניינות דורש טחינת רקמות מנותחות ודחיפתן דרך מסננת תאים עדינה כדי לסנן רקמת חיבור מהתאים הרצויים (איור 1A). בידוד סוגי תאים דבקים, כגון תאים דנדריטיים או מקרופאגים, או תאים מרקמות סיביות במיוחד, דורש שלבי הפרדה מכניים או אנזימטיים נוספים ^2,3,4. תהליך זה נעשה בדרך כלל באופן ידני, מה שהופך אותו לגוזל זמן רב ונוטה לשונות המשתמש בעת הערכת תפוקת התאים וכדאיות הדגימה. לכן, חיוני להציג אפשרויות הניתנות להתאמה אישית עבור דיסוציאציה אוטומטית של רקמות. בעוד שנעשו ניסיונות מסוימים לתכנן מערכות כאלה, האפשרויות הקיימות אינן תמיד נגישות, במיוחד במעבדות אקדמיות ובמסגרות דלות משאבים, בעיקר בשל האופי היקר של מכשירים אלה⁵. יתר על כן, מכשירים אלה אינם תמיד ניתנים להתאמה אישית לצרכים האישיים של קבוצת מחקר⁶.

כאן, מכשיר דיסוצייאטור רקמות תוכנן כדי להפוך את העיכול של רקמות שלמות או חתיכות רקמה לאוטומטי לתרחיפים חד-תאיים בעזרת אנזימי עיכול ושיבוש מכני. ניתן להרכיב מכשיר זה בקלות במעבדה, להכניס אותו לתאי חימום או קירור לצורך ויסות טמפרטורה, להתאים אותו למספר הרקמות הדרוש לניתוק, ולתכנת אותו עם פרוטוקולי הדיסוציאציה הרצויים. השימוש הנרחב במכשיר זה יכול לשפר באופן משמעותי את יכולת השחזור של פרוטוקולי מיצוי תאים ולספק חלופה חוסכת זמן לדיסוציאציה ידנית.

העיצוב מאפשר עיכול בו זמנית של עד 12 רקמות בתהליך אוטומטי. המכשיר מורכב מ -12 מנועים נפרדים המחוברים במקביל ומופעלים על ידי תקע קיר סטנדרטי באמצעות מתאם AC/DC עם חוגת מתח מתכווננת לשליטה על סיבוב / מהירות המנועים. המנועים מסובבים בורג משושה שמתאים היטב לחלק העליון של צינורות C. צינורות C מוחזקים במקומם על-ידי מתח כלפי מטה על לוח אקרילי שנצמד משני הצדדים ללוח העליון שבו מאובטחים המנועים (איור 1B). מכיוון שהמנועים מחווטים במקביל, מהירותם בכל מתח נתון לא אמורה להשתנות הרבה, אך העומס (מספר צינורות C המותקנים על המכשיר) ישפיע על המהירות גם כאשר המתח נשמר קבוע. כדי למדוד סיבובים לדקה (סל"ד), שולב טכומטר באמצעות חיישן אפקט הול ומגנט קבוע על אחד מפירי המנוע (איור משלים 1). קבצי CAD לבניית מערכים מוטוריים מסופקים בקובץ קידוד משלים 1. כלול גם מתג הניתן לתכנות כדי להפוך את כיוון הסיבוב על ידי היפוך המטענים החיוביים / שליליים המועברים למנועים. כל התכונות הללו משולבות באמצעות תוכנה מקודדת (תוכנת Arduino IDE, ראה טבלת חומרים) על Arduino Nano (קובץ קידוד משלים 2). באמצעות לחצנים מחוברים ופאנל LCD (איור משלים 2), ניתן ליצור ולהריץ פרוטוקולים שמורים ומותאמים אישית, להפוך אוטומטית את כיוון הסיבוב בזמנים מוגדרים של פרוטוקול, להתאים את המהירות באמצעות המתח (איור משלים 3), ולהציג את מהירות המנוע הנוכחית ואת הזמן שנותר להשלמת פרוטוקול מתוכנת (איור משלים 4).

עבור המחקר הנוכחי, תרחיפים חד-תאיים הוכנו באמצעות דיסוציאציה מכנית-אנזימטית של רקמות עם מכשיר זה ודיסוציאציה ידנית-אנזימטית של רקמות כדי לקבוע הבדלים, אם בכלל, בתאים שנמצאו עבור יישומים במורד הזרם. תכשירי התא הוערכו בהתבסס על סך תפוקת התאים לרקמה ואחוז הכדאיות של התא. ציטומטריית זרימה שימשה להשוואת הבדלים פוטנציאליים בביטוי סמן פני השטח. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת גרפים וניתוח סטטיסטי. מבחני t וולשיים לא מזווגים שימשו להשוואה בין זוגות דגימות או קבוצות, כאשר גודל הדגימה n > 4 עכברים המייצגים 2 ניסויים משוכפלים. הוראות מפורטות לייצור והרכבה של התקן זה ניתן למצוא בקובץ משלים 1. החומרים הדרושים לפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UMD (IACUC). רקמות מנקבות עכברי C57BL/6J בנות 7 עד 9 שבועות שימשו למחקרים אלה. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. דיסוציאציה ידנית

הערה: שלב זה נלקח מ- Maisel K. et ^al.7.

1. הסר רקמה שנותחה והנח אותה באמצעי תרבית תאים קרים עם סרום בקר עוברי 5% (FBS).
2. קוצצים את הרקמה באמצעות מספריים חדים לדיסקציה עד שהשברים קטנים מ-1 מ"מ בכל ממד.
3. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומוסיפים 5 מ"ל מדיה.
4. הוסף אנזימי עיכול המבוססים על סוגי הרקמה והתאים המבודדים. עבור הניסויים המוצגים, השתמש Collagenase 4 (1 מ"ג / מ"ל), Collagenase D (1 מ"ג / מ"ל), ו DNase (40 מיקרוגרם / מ"ל).
5. יש לדגור על שייקר או נדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C צלזיוס עם תסיסה עדינה לאורך כל הדגירה. פיפטה את המדגם למעלה ולמטה 100 פעמים.
6. הוסף EDTA כדי להשיג נפח דגימה עם ריכוז של 5 mM. פיפטה את הדגימה למעלה ולמטה 100 פעמים, ולאחר מכן פיפטה נמרצת את הדגימה למעלה ולמטה 100 פעמים.
7. העבירו את הדגימה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר ואספו אותה בצינור של 50 מ"ל או 15 מ"ל.
8. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant באמצעות פיפטה ותאי resuspend ב 1 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים. יש לדגור במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
9. נטרל את מאגר הליזיס על ידי הוספת 9 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר 1X (PBS).
10. צנטריפוגה את התאים שנאספו שוב ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant באמצעות פיפטה ו resuspend תאים במאגר הרצוי או מדיה.

2. דיסוציאציה מכנית חצי אוטומטית

1. הניחו רקמה מנותחת במצע תרבית תאים קרים עם סרום בקר עוברי 5% (FBS).
   הערה: פרוטוקול זה מיועד לבידוד תאים מרקמות מוצקות.
2. קוצצים את הרקמה באמצעות מספריים חדים לדיסקציה עד ששברי הרקמה מגיעים לכ-5 מ"מ בכל ממד. מעבירים את הרקמה הקצוצה לצינור C ומוסיפים 1 מ"ל מדיה.
3. טען את צינור C למכשיר. התאימו את לוחית מחזיק הצינור (איור משלים 1A) מעל תחתיות הצינור בצורת D.
4. הצמידו את הצינורות ללוחית המנוע על-ידי הצמדת זרועות המתח ללוח האקרילי (איור משלים 3).
5. הגדר תוכנית מותאמת אישית: קדימה, 30 שניות; הפוך, 10 שניות; לולאה, 4 פעמים.
   1. בחר מצב מותאם אישית מהתפריט הראשי על ידי לחיצה על הלחצן הכחול .
   2. בתפריט המצב המותאם אישית הראשון, ציין את משך הסיבוב קדימה ל- 30 שניות על-ידי לחיצה על הלחצן האדום עד שהערך במסך יקרא 30 שניות. לחץ על הכפתור הכחול כדי לבחור ערך זה ולהתקדם למסך התפריט הבא.
   3. בתפריט המצב המותאם אישית השני, ציין את משך הסיבוב ההפוך ל- 10 שניות על-ידי לחיצה על הלחצן האדום עד שהערך על המסך יקרא 10 שניות. לחץ על הכפתור הכחול כדי לבחור ערך זה ולהתקדם למסך התפריט הבא.
   4. בתפריט המצב המותאם אישית השלישי, ציין את מספר הפעמים שיש לחזור על הבחירות שנקבעו בשלבים 2.5.2-2.5.3 על-ידי לחיצה על הלחצן האדום עד שהערך על המסך יקרא 4X. לחץ על הכפתור הכחול כדי לבחור ערך זה ולהפעיל את התוכנית.
      הערה: תוכניות מותאמות אישית אינן מאוחסנות בזיכרון ההתקן, אך ניתן לתכנת אותן כאחת התוכניות המוגדרות מראש לפעולה מהירה יותר (הוראות תיכנות התקנים מסופקות בקובץ משלים 1).
6. הפעל את התוכנית המותאמת אישית במהירות 200 סל"ד על-ידי התאמת חוגת בקרת המתח (איור משלים 3) עד שערך הסל"ד המחושב בפינה הימנית התחתונה של מסך ה-LCD יקרא 200 (איור משלים 4).
7. הוסף אנזימי עיכול במדיה של 4 מ"ל בהתאם לסוגי הרקמה והתאים המבודדים.
   הערה: עבור הניסויים המוצגים, השתמש ב-Collagenase 4 (1 מ"ג/מ"ל), Collagenase D (1 מ"ג/מ"ל) ו-DNase (40 מיקרוגרם/מ"ל).
8. טען את צינור C למכשיר וחזור על שלבים 2.3-2.6 כדי להפעיל את התוכנית הבאה במהירות 200 סל"ד: קדימה, 30 שניות; הפוך, 10 שניות; לולאה, 4 פעמים.
9. העבר את המכשיר כשהצינורות עדיין טעונים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
10. טען את צינור C למכשיר וחזור על שלבים 2.3-2.6 כדי להפעיל את התוכנית הבאה במהירות 50 סל"ד: קדימה, 270 שניות; הפוך, 30 שניות; לולאה, 9 פעמים.
11. הוסף EDTA כדי להשיג ריכוז של 5 mM בדגימה.
12. טען את צינור C למכשיר וחזור על שלבים 2.3-2.6 כדי להפעיל את התוכנית הבאה במהירות 100 סל"ד: קדימה, 30 שניות; הפוך, 10 שניות; לולאה, פעמיים.
13. דחפו את הדגימה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר ואספו אותה בצינור של 50 מ"ל או 15 מ"ל.
14. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה ולהשהות מחדש תאים ב-1 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים. יש לדגור במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
15. נטרל את מאגר הליזיס עם 9 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר (PBS).
16. צנטריפוגה את התאים שנאספו שוב ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה והשהו מחדש תאים במאגר או במדיה הרצויים.

3. ניתוח נתונים

1. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת גרפים וניתוח סטטיסטי (ראה טבלת חומרים).
2. השתמש במבחני t לא מזווגים של וולש כדי להשוות זוגות של דגימות או קבוצות, עם גודל מדגם n > 4 עכברים המייצגים 2 ניסויים משוכפלים.
   הערה: הבדלים נחשבו מובהקים סטטיסטית כאשר (p < 0.05). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

תוצאות

פרוטוקול מכני חצי-אוטומטי זה יכול לשכפל תוצאות מניסויים שבהם תאים עובדו באופן ידני. תרחיפים של תאים שהוכנו באמצעות המכשיר הזה ובאמצעות דיסוציאציה ידנית מראים תפוקת תאים דומה ויכולת קיום של דגימות ברקמות ריאה, כליות ולב של עכברים (איור 2A,B). אוכלוסיות של תאי חיסון, ?...

Discussion

מכשיר זה תוכנן להרכבה קלה בסביבת המחקר כדי לספק תרחיפים חד-תאיים מרקמות שלמות לניתוח תא בודד לאחר מכן. התכונות, למרות שהן בסיסיות, מספיקות כדי לענות על הצרכים של חוקרים במסגרות אקדמיות ומחוצה לה. יתרון מרכזי של שימוש במכשיר זה הוא הפוטנציאל שלו לשפר את הכנת המתלים של תא בודד על ידי הפחתת הש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3