Motorlu bir cihaz kullanarak tek hücre analizi için dokuların mekanik ayrışması

Özet

Akış sitometrisi gibi aşağı akış analizleri için tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak üzere dokuların kombine enzimatik ve yarı otomatik mekanik ayrışması için genel bir protokol sağlanır. Bu protokol için geliştirilen düşük maliyetli mekanik cihazın imalatı, montajı ve çalıştırılması için talimatlar dahildir.

Özet

Doku örneklerinin analizi için tek hücreleri izole edebilmek ve hazırlayabilmek, yeni biyomedikal keşifler ve araştırmalar için hızla önemli hale geldi. Tek hücreli izolasyonlar için manuel protokoller oldukça zaman alıcıdır ve kullanıcı değişkenliğine eğilimlidir. Otomatik mekanik protokoller, işlem süresini ve numune değişkenliğini azaltabilir, ancak daha düşük kaynaklı araştırma ortamlarında kolayca erişilebilir veya uygun maliyetli değildir. Burada açıklanan cihaz, akademik laboratuvarlar için düşük maliyetli bir alternatif olarak ticari olarak temin edilebilen malzemeler kullanılarak yarı otomatik doku ayrışması için tasarlanmıştır. Cihaz tasarımının imalatı, montajı ve çalıştırılması için talimatlar sağlanmıştır. Ayrışma protokolü, birden fazla fare dokusunda manuel preparatlarla karşılaştırılabilir hücre verimleri ve numune canlılığı ile güvenilir bir şekilde tek hücreli süspansiyonlar üretir. Protokol, cihaz başına aynı anda 12 adede kadar doku örneğini işleme yeteneği sağlayarak büyük örnek boyutları gerektiren çalışmaları daha yönetilebilir hale getirir. Eşlik eden yazılım ayrıca, değişen dokulara ve deneysel kısıtlamalara uyum sağlamak için cihaz protokolünün özelleştirilmesine de izin verir.

Giriş

Tek hücreli analiz, akış sitometrisi, farklı hücre tiplerinin tanımlanması, tek hücre dizilimi veya hücreler arasındaki genomik veya transkriptomik varyasyonların tanımlanması gibi uygulamalar için yeni biyomedikal keşifler için hızla önemli hale gelmiştir¹. İlgilenilen dokulardan bu tür hücre izolasyonlarının gerçekleştirilmesi, disseke edilmiş dokuların kıyılmasını ve istenen hücrelerden bağ dokusunu filtrelemek için ince bir hücre süzgecinden itilmesini gerektirir (Şekil 1A). Dendritik hücreler veya makrofajlar veya özellikle fibröz dokulardan hücreler gibi yapışık hücre tiplerinin izole edilmesi, ek mekanik veya enzimatik ayırma adımları gerektirir ^2,3,4. Bu işlem genellikle manuel olarak yapılır, bu da hücre verimlerini ve numune canlılığını değerlendirirken oldukça zaman alıcı ve kullanıcı değişkenliğine eğilimli hale getirir. Bu nedenle, otomatik doku ayrışması için özelleştirilebilir seçenekler sunmak çok önemlidir. Bu tür sistemleri tasarlamak için bazı girişimlerde bulunulmuş olsa da, büyük ölçüde bu cihazların maliyet engelleyici doğası nedeniyle, özellikle akademik laboratuvarlarda ve daha düşük kaynak ortamlarında mevcut seçeneklere her zaman kolayca erişilememektedir⁵. Ayrıca, bu cihazlar her zaman bir araştırma grubunun bireysel ihtiyaçlarına göre özelleştirilemez⁶.

Burada, sindirim enzimleri ve mekanik bozulma yardımıyla tüm dokuların veya doku parçalarının tek hücreli süspansiyonlara sindirimini otomatikleştirmek için bir doku ayrıştırıcı cihaz tasarlandı. Bu cihaz laboratuvarda kolayca monte edilebilir, sıcaklık regülasyonu için ısıtma veya soğutma odalarına yerleştirilebilir, gerekli sayıda dokunun ayrışması için özelleştirilebilir ve istenen ayrışma protokolleri ile programlanabilir. Bu cihazın geniş kullanımı, hücre ekstraksiyon protokollerinin tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırabilir ve manuel ayrışmaya zaman kazandıran bir alternatif sağlayabilir.

Tasarım, otomatik bir işlemle 12 dokuya kadar aynı anda sindirime izin verir. Cihaz, paralel olarak bağlanmış ve motorların dönüşünü/hızını kontrol etmek için ayarlanabilir voltaj kadranlı bir AC/DC adaptör aracılığıyla standart bir duvar prizi ile çalışan 12 ayrı motordan oluşur. Motorlar, C-boruların üst kısmına sıkıca oturan altıgen bir cıvatayı döndürür. C-tüpleri, motorların sabitlendiği üst plakaya her iki taraftan kilitlenen akrilik bir plaka üzerinde aşağı doğru gerilimle yerinde tutulur (Şekil 1B). Motorlar paralel olarak bağlandığından, herhangi bir voltajdaki hızları çok fazla değişmemelidir, ancak voltaj sabit tutulduğunda bile yük (cihaza monte edilen C-tüplerinin sayısı) hızı etkileyecektir. Dakikadaki dönüşleri (rpm) ölçmek için, bir hall etkisi sensörü ve motor millerinden birine sabit bir mıknatıs kullanılarak bir takometre dahil edilmiştir (Ek Şekil 1). Motor dizileri oluşturmak için CAD dosyaları Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanır. Ayrıca, motorlara iletilen pozitif/negatif yükleri tersine çevirerek dönüş yönünü tersine çevirmek için programlanabilir bir anahtar da dahildir. Tüm bu özellikler, bir Arduino Nano (Ek Kodlama Dosyası 2) üzerinde kodlanmış yazılım (Arduino IDE yazılımı, Malzeme Tablosuna bakın) kullanılarak entegre edilmiştir. Bağlı düğmeleri ve bir LCD paneli (Ek Şekil 2) kullanarak, kaydedilmiş ve özel protokoller oluşturmak ve çalıştırmak, bir protokolün belirli zamanlarında dönüş yönünü otomatik olarak tersine çevirmek, voltajı kullanarak hızı ayarlamak (Ek Şekil 3) ve programlanmış bir protokolü tamamlamak için mevcut motor hızını ve kalan süreyi görüntülemek mümkündür (Ek Şekil 4).

Bu çalışma için, hem bu cihazla mekanik-enzimatik doku ayrışması hem de manuel-enzimatik doku ayrışması kullanılarak, aşağı akış uygulamaları için geri kazanılan hücrelerdeki farklılıkları belirlemek için tek hücreli süspansiyonlar hazırlandı. Hücre preparatları, doku başına toplam hücre verimine ve hücre canlılığı yüzdesine göre değerlendirildi. Yüzey marker ekspresyonundaki potansiyel farklılıkları karşılaştırmak için akış sitometrisi kullanıldı. Veriler grafik ve istatistiksel analiz programları kullanılarak analiz edilmiştir. Örneklem veya grup çiftlerini karşılaştırmak için eşlenmemiş Welch t-testleri kullanıldı ve örneklem büyüklükleri n > 4 fareyi temsil eden 2 tekrarlanan deney kullanıldı. Bu cihazın imalatı ve montajı için ayrıntılı talimatlar Ek Dosya 1'de bulunabilir. Bu protokol için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

Protokol

Bu protokol UMD Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmalar için 7 ila 9 haftalık dişi C57BL / 6J farelerinden alınan dokular kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Manuel ayrışma

NOT: Bu adım Maisel K. ve ^ark.7'den uyarlanmıştır.

1. Diseke edilmiş dokuyu çıkarın ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile soğuk hücre kültürü ortamına yerleştirin.
2. Parçalar herhangi bir boyutta 1 mm'den küçük olana kadar keskin diseksiyon makası kullanarak dokuyu kesin.
3. Kıyılmış dokuyu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 5 mL ortam ekleyin.
4. İzole edilen doku ve hücre tiplerine göre sindirim enzimleri ekleyin. Sunulan deneyler için Kollajenaz 4 (1 mg/mL), Kollajenaz D (1 mg/mL) ve DNaz (40 μg/mL) kullanın.
5. İnkübasyon boyunca hafif çalkalama ile 37 ° C'de 1 saat boyunca bir çalkalayıcı veya külbütör üzerinde inkübe edin. Numuneyi 100 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
6. 5 mM konsantrasyonlu bir numune hacmi elde etmek için EDTA ekleyin. Numuneyi 100 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından numuneyi 100 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
7. Numuneyi 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve 50 mL veya 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
8. Toplanan hücreleri 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
9. 9 mL soğuk 1X Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ekleyerek lizis tamponunu nötralize edin.
10. Toplanan hücreleri tekrar 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve hücreleri istenen tampon veya ortamda yeniden süspanse edin.

2. Yarı otomatik mekanik ayrışma

1. Diseke edilmiş dokuyu %5 fetal sığır serumu (FBS) içeren soğuk hücre kültürü ortamına yerleştirin.
   NOT: Bu protokol, katı dokulardan hücre izolasyonu için tasarlanmıştır.
2. Doku parçaları herhangi bir boyutta yaklaşık 5 mm olana kadar keskin diseksiyon makası kullanarak dokuyu kesin. Kıyılmış dokuyu bir C-tüpüne aktarın ve 1 mL ortam ekleyin.
3. C-tüpünü cihaza yükleyin. Tüp tutucu plakayı (Ek Şekil 1A) D şeklindeki tüp tabanlarının üzerine takın.
4. Gergi kollarını akrilik plakaya kilitleyerek boruları motor plakasına sabitleyin (Ek Şekil 3).
5. Özel bir program ayarlayın: İleri, 30 sn; Ters, 10 sn; Döngü, 4 kez.
   1. Mavi düğmeye basarak Ana Menü'den Özel Mod'u seçin.
   2. İlk özel mod menüsünde, ekrandaki değer 30 s okuyana kadar kırmızı düğmeye basarak ileri dönüş süresini 30 s olarak belirtin. Bu değeri seçmek ve bir sonraki menü ekranına ilerlemek için mavi düğmeye basın.
   3. İkinci özel mod menüsünde, ekrandaki değer 10 sn okuyana kadar kırmızı düğmeye basarak ters dönüş süresini 10 sn olarak belirtin. Bu değeri seçmek ve bir sonraki menü ekranına ilerlemek için mavi düğmeye basın.
   4. Üçüncü özel mod menüsünde, ekrandaki değer 4X okuyana kadar kırmızı düğmeye basarak 2.5.2-2.5.3 adımlarında ayarlanan seçimlerin kaç kez tekrarlanacağını belirtin. Bu değeri seçmek ve programı başlatmak için mavi düğmeye basın.
      NOT: Özel programlar cihaz hafızasında saklanmaz, ancak daha hızlı çalışma için önceden ayarlanmış programlardan biri olarak programlanabilir (cihaz programlama talimatları Ek Dosya 1'de verilmiştir).
6. LCD Ekranın sağ alt köşesindeki hesaplanan rpm değeri 200 (Ek Şekil 3) okuyana kadar voltaj kontrol kadranını (Ek Şekil 3) ayarlayarak özel programı 4 rpm'de çalıştırın.
7. İzole edilen doku ve hücre tiplerine göre 4 mL'lik ortama sindirim enzimleri ekleyin.
   NOT: Sunulan deneyler için Kollajenaz 4 (1 mg/mL), Kollajenaz D (1 mg/mL) ve DNaz (40 μg/mL) kullanın.
8. C-tüpünü cihaza yükleyin ve aşağıdaki programı 2.3 rpm'de çalıştırmak için 2.6-200 adımlarını tekrarlayın: İleri, 30 sn; Ters, 10 sn; Döngü, 4 kez.
9. Cihazı, tüpler hala yüklüyken 45 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın.
10. C-tüpünü cihaza yükleyin ve aşağıdaki programı 50 rpm'de çalıştırmak için 2.3-2.6 arasındaki adımları tekrarlayın: İleri, 270 sn; Ters, 30 sn; Döngü, 9 kez.
11. Numunede 5 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için EDTA ekleyin.
12. C-tüpünü cihaza yükleyin ve aşağıdaki programı 2.3 rpm'de çalıştırmak için 2.6-100 arasındaki adımları tekrarlayın: İleri, 30 sn; Ters, 10 sn; Döngü, 2 kez.
13. Numuneyi 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve 50 mL veya 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
14. Toplanan hücreleri 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
15. Lizis tamponunu 9 mL soğuk Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile nötralize edin.
16. Toplanan hücreleri tekrar 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri istenen tampon veya ortamda yeniden süspanse edin.

3. Veri analizi

1. Bir grafik ve istatistiksel analiz yazılımı kullanarak verileri analiz edin (bkz.
2. 2 tekrarlanan deneyi temsil eden n > 4 fare örneklem büyüklükleri ile örneklem veya grup çiftlerini karşılaştırmak için eşleştirilmemiş Welch t-testlerini kullanın.
   NOT: Farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (p < 0.05). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

Sonuçlar

Bu yarı otomatik mekanik protokol, hücrelerin manuel olarak işlendiği deneylerden elde edilen sonuçları çoğaltabilir. Bu cihaz kullanılarak ve manuel ayrışma ile hazırlanan hücre süspansiyonları, fare akciğeri, böbreği ve kalp dokuları arasında karşılaştırılabilir hücre verimleri ve numune canlılığı gösterir (Şekil 2A, B). T hücreleri ve dendritik hücreler gibi bağışıklık hücrelerinin popülasyonları, izolasyon protokolündeki bir far...

Tartışmalar

Bu cihaz, sonraki tek hücreli analiz için tüm dokulardan tek hücreli süspansiyonlar sağlamak üzere araştırma ortamında kolay montaj için tasarlanmıştır. Özellikler, temel olmakla birlikte, akademik ortamlarda ve ötesinde araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için yeterlidir. Bu cihazı kullanmanın önemli bir yararı, değişkenliği azaltarak tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasını iyileştirme potansiyelidir. Ek olarak, 12+ numuneyi aynı anda işleme yeteneği, numuneden numune...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3