Dissociação mecânica de tecidos para análise unicelular utilizando dispositivo motorizado

Resumo

Um protocolo geral para a dissociação mecânica enzimática e semi-automatizada combinada de tecidos para gerar suspensões unicelulares para análises a jusante, como citometria de fluxo, é fornecido. Instruções para a fabricação, montagem e operação do dispositivo mecânico de baixo custo desenvolvido para este protocolo estão incluídas.

Resumo

Ser capaz de isolar e preparar células únicas para a análise de amostras de tecido tornou-se rapidamente crucial para novas descobertas e pesquisas biomédicas. Protocolos manuais para isolamentos de célula única são altamente demorados e propensos à variabilidade do usuário. Os protocolos mecânicos automatizados são capazes de reduzir o tempo de processamento e a variabilidade da amostra, mas não são facilmente acessíveis ou econômicos em ambientes de pesquisa com menos recursos. O dispositivo aqui descrito foi projetado para dissociação tecidual semi-automatizada usando materiais disponíveis comercialmente como uma alternativa de baixo custo para laboratórios acadêmicos. Instruções para fabricar, montar e operar o design do dispositivo foram fornecidas. O protocolo de dissociação produz suspensões de célula única de forma confiável com rendimentos celulares comparáveis e viabilidade de amostra para preparações manuais em vários tecidos de camundongos. O protocolo fornece a capacidade de processar até 12 amostras de tecido simultaneamente por dispositivo, tornando os estudos que exigem grandes tamanhos de amostra mais gerenciáveis. O software que o acompanha também permite a personalização do protocolo do dispositivo para acomodar tecidos variados e restrições experimentais.

Introdução

A análise unicelular tornou-se rapidamente crucial para novas descobertas biomédicas, seja para aplicações como citometria de fluxo, identificação de diferentes tipos celulares, sequenciamento unicelular, seja para identificar variações genômicas ou transcriptômicas entre células¹. A realização desses isolamentos celulares a partir de tecidos de interesse requer a picagem de tecidos dissecados e empurrá-los através de um filtro de células finas para filtrar o tecido conjuntivo das células desejadas (Figura 1A). O isolamento de tipos celulares aderentes, como células dendríticas ou macrófagos, ou células de tecidos particularmente fibrosos, requer etapas adicionais de separação mecânica ou enzimática ^2,3,4. Esse processo geralmente é feito manualmente, tornando-o altamente demorado e propenso à variabilidade do usuário ao avaliar o rendimento das células e a viabilidade da amostra. Portanto, é crucial introduzir opções personalizáveis para a dissociação automatizada de tecidos. Embora algumas tentativas tenham sido feitas para projetar tais sistemas, as opções existentes nem sempre são prontamente acessíveis, particularmente em laboratórios acadêmicos e ambientes com poucos recursos, em grande parte devido à natureza proibitiva de custo desses dispositivos⁵. Além disso, esses dispositivos nem sempre são personalizáveis às necessidades individuais de um grupo de pesquisa⁶.

Aqui, um dispositivo dissociador de tecido foi projetado para automatizar a digestão de tecidos inteiros ou pedaços de tecido em suspensões de célula única com a ajuda de enzimas digestivas e interrupção mecânica. Este dispositivo pode ser facilmente montado no laboratório, colocado em câmaras de aquecimento ou resfriamento para regulação de temperatura, personalizado para o número necessário de tecidos a dissociar e programado com os protocolos de dissociação desejados. O amplo uso desse dispositivo poderia melhorar significativamente a reprodutibilidade de protocolos de extração celular e fornecer uma alternativa de economia de tempo à dissociação manual.

O projeto permite a digestão simultânea de até 12 tecidos através de um processo automatizado. O dispositivo é composto por 12 motores individuais ligados em paralelo e alimentados por um plugue de parede padrão através de um adaptador AC / DC com um seletor de tensão ajustável para controlar a rotação / velocidade dos motores. Os motores giram um parafuso hexadecimal que se encaixa perfeitamente na parte superior dos tubos C. Os tubos em C são mantidos no lugar por tensão descendente em uma placa de acrílico que se prende de ambos os lados à placa superior onde os motores são fixados (Figura 1B). Como os motores são conectados em paralelo, sua velocidade em qualquer tensão não deve variar muito, mas a carga (o número de tubos C montados no dispositivo) afetará a velocidade mesmo quando a tensão for mantida constante. Para medir as rotações por minuto (rpm), um tacômetro foi incorporado usando um sensor de efeito hall e um ímã fixo em um dos eixos do motor (Figura Suplementar 1). Os arquivos CAD para a construção de matrizes de motor são fornecidos no Arquivo de Codificação Suplementar 1. Também está incluído um interruptor programável para inverter a direção da rotação, invertendo as cargas positivas/negativas entregues aos motores. Todos esses recursos são integrados usando software codificado (software Arduino IDE, consulte Tabela de Materiais) em um Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Usando botões conectados e um painel LCD (Figura 2 Suplementar), é possível criar e executar protocolos salvos e personalizados, inverter automaticamente a direção rotacional em horários especificados de um protocolo, ajustar a velocidade usando a tensão (Figura Suplementar 3) e exibir a velocidade atual do motor e o tempo restante para completar um protocolo programado (Figura 4 Suplementar).

Para o presente estudo, suspensões unicelulares foram preparadas usando dissociação tecidual mecânico-enzimática com este dispositivo e dissociação tecidual enzimático manual para determinar diferenças, se houver, em células recuperadas para aplicações a jusante. As preparações celulares foram avaliadas com base no rendimento total de células por tecido e na porcentagem de viabilidade celular. A citometria de fluxo foi utilizada para comparar possíveis diferenças na expressão de marcadores de superfície. Os dados foram analisados por meio de software de análise gráfica e estatística. Testes t de Welch não pareados foram usados para comparar pares de amostras ou grupos, com tamanhos amostrais n > 4 camundongos representando 2 experimentos replicados. Instruções detalhadas para a fabricação e montagem deste dispositivo podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 1. Os materiais necessários para este protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UMD (IACUC). Tecidos de camundongos fêmeas C57BL/6J de 7 a 9 semanas de idade foram usados para esses estudos. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Dissociação manual

NOTA: Esta etapa é adaptada de Maisel K. et ^al.7.

1. Retirar o tecido dissecado e colocá-lo em meio de cultura de células frias com soro fetal bovino (SFB) a 5%.
2. Pique o tecido com uma tesoura de dissecção afiada até que os fragmentos sejam menores que 1 mm em qualquer dimensão.
3. Transfira o tecido picado para um tubo cônico de 15 mL e adicione 5 mL de meio.
4. Adicionar enzimas de digestão com base nos tipos de tecido e células que estão sendo isolados. Para os experimentos apresentados, utilizar Colagenase 4 (1 mg/mL), Colagenase D (1 mg/mL) e DNase (40 μg/mL).
5. Incubar num agitador ou balancim durante 1 h a 37 °C com agitação suave durante toda a incubação. Pipetar a amostra para cima e para baixo 100 vezes.
6. Adicionar EDTA para obter um volume de amostra com uma concentração de 5 mM. Pipetar a amostra para cima e para baixo 100 vezes e, em seguida, pipetar vigorosamente a amostra para cima e para baixo 100 vezes.
7. Passar a amostra através de um filtro celular de 70 μm e coletá-la em um tubo de 50 mL ou 15 mL.
8. Centrifugar as células recolhidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda as células em 1 mL de tampão de lise de hemácias. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
9. Neutralizar o tampão de lise adicionando 9 mL de solução salina tamponada com fosfato 1X a frio (PBS).
10. Centrifugar novamente as células recolhidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda as células no buffer ou mídia desejados.

2. Dissociação mecânica semi-automatizada

1. Colocar o tecido dissecado em meio de cultura de células frias com 5% de soro fetal bovino (SFB).
   NOTA: Este protocolo destina-se ao isolamento celular de tecidos sólidos.
2. Pique o tecido com uma tesoura de dissecção afiada até que os fragmentos de tecido tenham aproximadamente 5 mm em qualquer dimensão. Transfira o tecido picado para um tubo C e adicione 1 mL de meio.
3. Carregue o tubo C no dispositivo. Encaixe a placa do suporte do tubo (Figura 1A suplementar) sobre os fundos do tubo em forma de D.
4. Fixe os tubos na placa do motor prendendo os braços de tensão na placa de acrílico (Figura 3 Suplementar).
5. Defina um programa personalizado: Avançar, 30 s; Reverso, 10 s; Loop, 4 vezes.
   1. Escolha Modo Personalizado no Menu Principal pressionando o botão azul .
   2. No primeiro menu de modo personalizado, especifique a duração da rotação para frente para 30 s pressionando o botão vermelho até que o valor na tela leia 30 s. Pressione o botão azul para selecionar esse valor e avançar para a próxima tela de menu.
   3. No segundo menu de modo personalizado, especifique a duração da rotação reversa para 10 s pressionando o botão vermelho até que o valor na tela leia 10 s. Pressione o botão azul para selecionar esse valor e avançar para a próxima tela de menu.
   4. No terceiro menu de modo personalizado, especifique o número de vezes para repetir as seleções definidas nas etapas 2.5.2-2.5.3 pressionando o botão vermelho até que o valor na tela leia 4X. Pressione o botão azul para selecionar esse valor e iniciar o programa.
      Observação : programas personalizados não são armazenados na memória do dispositivo, mas podem ser programados como um dos programas predefinidos para operação mais rápida (instruções de programação do dispositivo são fornecidas no arquivo suplementar 1).
6. Execute o programa personalizado a 200 rpm ajustando o seletor de controle de tensão (Figura 3 Suplementar) até que o valor de rpm calculado no canto inferior direito da tela LCD leia 200 (Figura Suplementar 4).
7. Adicionar enzimas de digestão em meios de 4 mL de acordo com os tipos de tecido e células a serem isolados.
   OBS: Para os experimentos apresentados, utilizar Colagenase 4 (1 mg/mL), Colagenase D (1 mg/mL) e DNase (40 μg/mL).
8. Carregue o tubo C no dispositivo e repita as etapas 2.3-2.6 para executar o seguinte programa a 200 rpm: Avançar, 30 s; Reverso, 10 s; Loop, 4 vezes.
9. Transfira o dispositivo com os tubos ainda carregados para uma incubadora de 37 °C por 45 min.
10. Carregue o tubo C no dispositivo e repita as etapas 2.3-2.6 para executar o seguinte programa a 50 rpm: Avançar, 270 s; Reverso, 30 s; Loop, 9 vezes.
11. Adicionar EDTA para atingir uma concentração de 5 mM na amostra.
12. Carregue o tubo C no dispositivo e repita as etapas 2.3-2.6 para executar o seguinte programa a 100 rpm: Avançar, 30 s; Reverso, 10 s; Loop, 2 vezes.
13. Empurrar a amostra através de um filtro celular de 70 μm e coletá-la em um tubo de 50 mL ou 15 mL.
14. Centrifugar as células recolhidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda as células em 1 mL de tampão de lise de hemácias. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
15. Neutralizar o tampão de lise com 9 mL de solução salina tamponada com fosfato a frio (PBS).
16. Centrifugar novamente as células recolhidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda as células no buffer ou mídia desejados.

3. Análise dos dados

1. Analise os dados usando um software de análise gráfica e estatística (consulte Tabela de Materiais).
2. Use testes t de Welch não pareados para comparar pares de amostras ou grupos, com tamanhos de amostra n > 4 camundongos representando 2 experimentos replicados.
   LEGENDA: As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando (p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados

Este protocolo mecânico semi-automatizado pode replicar resultados de experimentos em que as células foram processadas manualmente. Suspensões celulares preparadas com este dispositivo e por dissociação manual mostram rendimentos celulares comparáveis e viabilidade de amostras em tecidos pulmonares, renais e cardíacos de camundongos (Figura 2A,B). Populações de células imunes, como células T e células dendríticas, não foram significativamente afetadas por uma d...

Discussão

Este dispositivo foi projetado para fácil montagem no ambiente de pesquisa para fornecer suspensões de célula única de tecidos inteiros para posterior análise de célula única. Os recursos, embora básicos, são suficientes para atender às necessidades de pesquisadores em ambientes acadêmicos e além. Um dos principais benefícios do uso deste dispositivo é seu potencial para melhorar a preparação de suspensões de célula única, reduzindo a variabilidade. Além disso, a capacidade de processar 12+ amostras s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3