Disociación mecánica de tejidos para el análisis de células individuales mediante un dispositivo motorizado

Resumen

Se proporciona un protocolo general para la disociación mecánica enzimática y semiautomatizada combinada de tejidos para generar suspensiones unicelulares para análisis posteriores, como la citometría de flujo. Se incluyen instrucciones para la fabricación, montaje y operación del dispositivo mecánico de bajo costo desarrollado para este protocolo.

Resumen

Ser capaz de aislar y preparar células individuales para el análisis de muestras de tejido se ha convertido rápidamente en algo crucial para los nuevos descubrimientos e investigaciones biomédicas. Los protocolos manuales para el aislamiento de una sola célula consumen mucho tiempo y son propensos a la variabilidad del usuario. Los protocolos mecánicos automatizados pueden reducir el tiempo de procesamiento y la variabilidad de las muestras, pero no son fácilmente accesibles ni rentables en entornos de investigación con menos recursos. El dispositivo descrito aquí fue diseñado para la disociación semiautomatizada de tejidos utilizando materiales disponibles comercialmente como una alternativa de bajo costo para los laboratorios académicos. Se han proporcionado instrucciones para fabricar, ensamblar y operar el diseño del dispositivo. El protocolo de disociación produce de forma fiable suspensiones unicelulares con rendimientos celulares y viabilidad de muestras comparables a las preparaciones manuales en múltiples tejidos de ratón. El protocolo proporciona la capacidad de procesar hasta 12 muestras de tejido simultáneamente por dispositivo, lo que hace que los estudios que requieren grandes tamaños de muestra sean más manejables. El software que lo acompaña también permite personalizar el protocolo del dispositivo para adaptarse a los diferentes tejidos y restricciones experimentales.

Introducción

El análisis de una sola célula se ha convertido rápidamente en crucial para los nuevos descubrimientos biomédicos, ya sea para aplicaciones como la citometría de flujo, la identificación de diferentes tipos de células, la secuenciación de una sola célula o para la identificación de variaciones genómicas o transcriptómicas^{entre células}. La realización de este tipo de aislamientos celulares a partir de tejidos de interés requiere picar los tejidos disecados y empujarlos a través de un fino filtro celular para filtrar el tejido conectivo de las células deseadas (Figura 1A). El aislamiento de tipos de células adherentes, como células dendríticas o macrófagos, o células de tejidos particularmente fibrosos, requiere pasos adicionales de separación mecánica o enzimática ^2,3,4. Este proceso generalmente se realiza manualmente, lo que lo hace muy lento y propenso a la variabilidad del usuario al evaluar el rendimiento celular y la viabilidad de la muestra. Por lo tanto, es crucial introducir opciones personalizables para la disociación automatizada de tejidos. Si bien se han hecho algunos intentos de diseñar tales sistemas, las opciones existentes no siempre son fácilmente accesibles, particularmente en laboratorios académicos y entornos de bajos recursos, en gran parte debido a la naturaleza prohibitiva de estos dispositivos⁵. Además, estos dispositivos no siempre son personalizables a las necesidades individuales de un grupo de investigación⁶.

Aquí, se diseñó un dispositivo disociador de tejidos para automatizar la digestión de tejidos enteros o trozos de tejido en suspensiones unicelulares con la ayuda de enzimas digestivas y disrupciones mecánicas. Este dispositivo se puede ensamblar fácilmente en el laboratorio, colocar en cámaras de calentamiento o enfriamiento para regular la temperatura, personalizar para el número requerido de tejidos a disociar y programar con los protocolos de disociación deseados. El uso generalizado de este dispositivo podría mejorar significativamente la reproducibilidad de los protocolos de extracción celular y proporcionar una alternativa que ahorra tiempo a la disociación manual.

El diseño permite la digestión simultánea de hasta 12 tejidos a través de un proceso automatizado. El dispositivo está compuesto por 12 motores individuales cableados en paralelo y alimentados por un enchufe de pared estándar a través de un adaptador de CA/CC con un dial de voltaje ajustable para controlar la rotación/velocidad de los motores. Los motores giran un perno hexagonal que encaja perfectamente en la parte superior de los tubos C. Los tubos C se mantienen en su lugar mediante una tensión hacia abajo en una placa acrílica que se engancha a cada lado de la placa superior donde se aseguran los motores (Figura 1B). Debido a que los motores están conectados en paralelo, su velocidad a cualquier voltaje dado no debería variar mucho, pero la carga (la cantidad de tubos C montados en el dispositivo) afectará la velocidad incluso cuando el voltaje se mantenga constante. Para medir las rotaciones por minuto (rpm), se ha incorporado un tacómetro mediante un sensor de efecto Hall y un imán fijo en uno de los ejes del motor (Figura complementaria 1). Los archivos CAD para la construcción de matrices de motores se proporcionan en el Archivo de codificación suplementario 1. También se incluye un interruptor programable para invertir la dirección de rotación invirtiendo las cargas positivas/negativas entregadas a los motores. Todas estas características se integran mediante software codificado (software Arduino IDE, consulte la Tabla de materiales) en un Arduino Nano (Archivo de codificación suplementario 2). Usando botones conectados y un panel LCD (Figura complementaria 2), es posible crear y ejecutar protocolos guardados y personalizados, invertir automáticamente la dirección de rotación en momentos específicos de un protocolo, ajustar la velocidad usando el voltaje (Figura complementaria 3) y mostrar la velocidad actual del motor y el tiempo restante para completar un protocolo programado (Figura complementaria 4).

Para el presente estudio, se prepararon suspensiones unicelulares utilizando tanto la disociación de tejido mecánico-enzimático con este dispositivo como la disociación manual-enzimática de tejido para determinar las diferencias, si las hubiera, en las células recuperadas para aplicaciones posteriores. Las preparaciones celulares se evaluaron en función de los rendimientos celulares totales por tejido y el porcentaje de viabilidad celular. Se utilizó la citometría de flujo para comparar las posibles diferencias en la expresión de marcadores de superficie. Los datos fueron analizados mediante software de graficación y análisis estadístico. Se utilizaron pruebas t de Welch no apareadas para comparar pares de muestras o grupos, con tamaños de muestra n > 4 ratones que representaban 2 experimentos replicados. Las instrucciones detalladas para la fabricación y el montaje de este dispositivo se pueden encontrar en el Archivo Complementario 1. Los materiales necesarios para este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la UMD. Para estos estudios se utilizaron tejidos de ratones hembra C57BL/6J de 7 a 9 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Disociación manual

NOTA: Este paso es una adaptación de Maisel K. et ^al.7.

1. Extraer el tejido diseccionado y colocarlo en medios de cultivo celular frío con suero fetal bovino (FBS) al 5%.
2. Picar el tejido con unas tijeras de disección afiladas hasta que los fragmentos tengan menos de 1 mm en cualquier dimensión.
3. Transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 15 ml y agregue 5 ml de medio.
4. Agregue enzimas digestivas en función de los tipos de tejido y células que se aíslan. Para los experimentos presentados, utilice colagenasa 4 (1 mg/mL), colagenasa D (1 mg/mL) y DNasa (40 μg/mL).
5. Incubar en un agitador o balancín durante 1 h a 37 °C con una agitación suave durante toda la incubación. Pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo 100 veces.
6. Agregue EDTA para lograr un volumen de muestra con una concentración de 5 mM. Pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo 100 veces, y luego pipetear vigorosamente la muestra hacia arriba y hacia abajo 100 veces.
7. Pase la muestra a través de un filtro de células de 70 μm y recójala en un tubo de 50 ml o 15 ml.
8. Centrifugar las células recogidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente.
9. Neutralice el tampón de lisis añadiendo 9 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X fría.
10. Centrifugar de nuevo las células recogidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender las células en el tampón o medio deseado.

2. Disociación mecánica semiautomatizada

1. Coloque el tejido diseccionado en medios de cultivo celular frío con suero fetal bovino (FBS) al 5%.
   NOTA: Este protocolo está diseñado para el aislamiento celular de tejidos sólidos.
2. Picar el tejido con unas tijeras de disección afiladas hasta que los fragmentos de tejido tengan aproximadamente 5 mm de dimensión. Transfiera el pañuelo picado a un tubo en C y agregue 1 ml de medio.
3. Cargue el tubo C en el dispositivo. Coloque la placa de soporte del tubo (Figura suplementaria 1A) sobre la parte inferior del tubo en forma de D.
4. Fije los tubos a la placa del motor enganchando los brazos tensores en la placa acrílica (Figura complementaria 3).
5. Establezca un programa personalizado: Adelante, 30 s; Marcha atrás, 10 s; Bucle, 4 veces.
   1. Elija el modo personalizado en el menú principal presionando el botón azul .
   2. En el primer menú de modo personalizado, especifique la duración de la rotación hacia adelante a 30 s presionando el botón rojo hasta que el valor en la pantalla sea de 30 s. Presione el botón azul para seleccionar este valor y avanzar a la siguiente pantalla del menú.
   3. En el segundo menú de modo personalizado, especifique la duración de la rotación inversa a 10 s pulsando el botón rojo hasta que el valor en la pantalla sea de 10 s. Presione el botón azul para seleccionar este valor y avanzar a la siguiente pantalla del menú.
   4. En el tercer menú de modo personalizado, especifique el número de veces que desea repetir las selecciones establecidas en los pasos 2.5.2-2.5.3 presionando el botón rojo hasta que el valor en la pantalla sea 4X. Presione el botón azul para seleccionar este valor e iniciar el programa.
      NOTA: Los programas personalizados no se almacenan en la memoria del dispositivo, pero se pueden programar como uno de los programas preestablecidos para un funcionamiento más rápido (las instrucciones de programación del dispositivo se proporcionan en el Archivo complementario 1).
6. Ejecute el programa personalizado a 200 rpm ajustando el dial de control de voltaje (Figura complementaria 3) hasta que el valor de rpm calculado en la esquina inferior derecha de la pantalla LCD indique 200 (Figura complementaria 4).
7. Agregue enzimas de digestión en medios de 4 ml de acuerdo con los tipos de tejido y células que se aíslan.
   NOTA: Para los experimentos presentados, utilice colagenasa 4 (1 mg/mL), colagenasa D (1 mg/mL) y DNasa (40 μg/mL).
8. Cargue el tubo C en el dispositivo y repita los pasos 2.3-2.6 para ejecutar el siguiente programa a 200 rpm: Adelante, 30 s; Marcha atrás, 10 s; Bucle, 4 veces.
9. Transfiera el dispositivo con los tubos aún cargados a una incubadora a 37 °C durante 45 min.
10. Cargue el tubo C en el dispositivo y repita los pasos 2.3-2.6 para ejecutar el siguiente programa a 50 rpm: Adelante, 270 s; Marcha atrás, 30 s; Bucle, 9 veces.
11. Agregue EDTA para lograr una concentración de 5 mM en la muestra.
12. Cargue el tubo C en el dispositivo y repita los pasos 2.3-2.6 para ejecutar el siguiente programa a 100 rpm: Adelante, 30 s; Marcha atrás, 10 s; Bucle, 2 veces.
13. Empuje la muestra a través de un filtro de células de 70 μm y recójala en un tubo de 50 ml o 15 ml.
14. Centrifugar las células recogidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente.
15. Neutralizar el tampón de lisis con 9 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría.
16. Centrifugar de nuevo las células recogidas a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender las células en el tampón o medio deseado.

3. Análisis de datos

1. Analice los datos utilizando un software de gráficos y análisis estadístico (ver Tabla de Materiales).
2. Utilice pruebas t de Welch no apareadas para comparar pares de muestras o grupos, con tamaños de muestra n > 4 ratones que representan 2 experimentos replicados.
   NOTA: Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando (p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados

Este protocolo mecánico semiautomatizado puede replicar los resultados de experimentos en los que las células se procesaron manualmente. Las suspensiones celulares preparadas con este dispositivo y por disociación manual muestran rendimientos celulares comparables y viabilidad de la muestra en tejidos pulmonares, renales y cardíacos de ratón (Figura 2A, B). Las poblaciones de células inmunitarias, como las células T y las células dendríticas, no se vieron afectadas ...

Discusión

Este dispositivo fue diseñado para un fácil ensamblaje en el entorno de investigación para proporcionar suspensiones unicelulares a partir de tejidos enteros para su posterior análisis de células individuales. Las características, aunque básicas, son suficientes para satisfacer las necesidades de los investigadores en entornos académicos y más allá. Un beneficio clave del uso de este dispositivo es su potencial para mejorar la preparación de suspensiones unicelulares al reducir la variabilidad. Además, la cap...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3