Disociación mecánica de tejidos para el análisis de células individuales mediante un dispositivo motorizado

Resumen

Se proporciona un protocolo general para la disociación mecánica enzimática y semiautomatizada combinada de tejidos para generar suspensiones unicelulares para análisis posteriores, como la citometría de flujo. Se incluyen instrucciones para la fabricación, montaje y operación del dispositivo mecánico de bajo costo desarrollado para este protocolo.

Resumen

Ser capaz de aislar y preparar células individuales para el análisis de muestras de tejido se ha convertido rápidamente en algo crucial para los nuevos descubrimientos e investigaciones biomédicas. Los protocolos manuales para el aislamiento de una sola célula consumen mucho tiempo y son propensos a la variabilidad del usuario. Los protocolos mecánicos automatizados pueden reducir el tiempo de procesamiento y la variabilidad de las muestras, pero no son fácilmente accesibles ni rentables en entornos de investigación con menos recursos. El dispositivo descrito aquí fue diseñado para la disociación semiautomatizada de tejidos utilizando materiales disponibles comercialmente como una alternativa de bajo costo para los laboratorios académicos. Se han proporcionado instrucciones para fabricar, ensamblar y operar el diseño del dispositivo. El protocolo de disociación produce de forma fiable suspensiones unicelulares con rendimientos celulares y viabilidad de muestras comparables a las preparaciones manuales en múltiples tejidos de ratón. El protocolo proporciona la capacidad de procesar hasta 12 muestras de tejido simultáneamente por dispositivo, lo que hace que los estudios que requieren grandes tamaños de muestra sean más manejables. El software que lo acompaña también permite personalizar el protocolo del dispositivo para adaptarse a los diferentes tejidos y restricciones experimentales.

Introducción

El análisis de una sola célula se ha convertido rápidamente en crucial para los nuevos descubrimientos biomédicos, ya sea para aplicaciones como la citometría de flujo, la identificación de diferentes tipos de células, la secuenciación de una sola célula o para la identificación de variaciones genómicas o transcriptómicas^{entre células}. La realización de este tipo de aislamientos celulares a partir de tejidos de interés requiere picar los tejidos disecados y empujarlos a través de un fino filtro celular para filtrar el tejido conectivo de las células deseadas (Figura 1A). El aislamiento de tipos de células adherente....

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la UMD. Para estos estudios se utilizaron tejidos de ratones hembra C57BL/6J de 7 a 9 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Disociación manual

NOTA: Este paso es una adaptación de Maisel K. et ^al.7.

1. Extraer el tejido diseccionado y colocarlo en medios de cultivo celular frío con suero fetal bovino (FBS) al 5%.
2. Picar el tejido con unas tijeras de disección afiladas hasta que los fragm....

Discusión

Este dispositivo fue diseñado para un fácil ensamblaje en el entorno de investigación para proporcionar suspensiones unicelulares a partir de tejidos enteros para su posterior análisis de células individuales. Las características, aunque básicas, son suficientes para satisfacer las necesidades de los investigadores en entornos académicos y más allá. Un beneficio clave del uso de este dispositivo es su potencial para mejorar la preparación de suspensiones unicelulares al reducir la variabilidad. Además, la cap.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3