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요약

유세포 분석과 같은 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직의 결합된 효소 및 반자동 기계적 해리를 위한 일반 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜을 위해 개발된 저비용 기계 장치의 제조, 조립 및 작동에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

초록

조직 샘플 분석을 위해 단일 세포를 분리하고 준비할 수 있는 능력은 새로운 생물의학 발견 및 연구에 빠르게 중요해지고 있습니다. 단일 세포 분리를 위한 수동 프로토콜은 시간이 많이 걸리고 사용자 변동성이 발생하기 쉽습니다. 자동화된 기계 프로토콜은 처리 시간과 시료 변동성을 줄일 수 있지만 리소스가 부족한 연구 환경에서는 쉽게 접근할 수 없거나 비용 효율적이지 않습니다. 여기에 설명된 장치는 학술 실험실을 위한 저비용 대안으로 상업적으로 이용 가능한 재료를 사용하여 반자동 조직 해리를 위해 설계되었습니다. 장치 설계를 제작, 조립 및 작동하기 위한 지침이 제공되었습니다. 해리 프로토콜은 여러 마우스 조직에서 수동 전처리와 유사한 세포 수율 및 샘플 생존율을 가진 단일 세포 현탁액을 안정적으로 생성합니다. 이 프로토콜은 장치당 최대 12개의 조직 샘플을 동시에 처리할 수 있는 기능을 제공하므로 큰 샘플 크기가 필요한 연구를 보다 쉽게 관리할 수 있습니다. 또한 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하면 다양한 조직과 실험 제약 조건을 수용하기 위해 장치 프로토콜을 사용자 정의할 수 있습니다.

서문

단일 세포 분석은 유세포 분석, 다양한 세포 유형 식별, 단일 세포 염기서열 분석 또는 세포 간 게놈 또는 전사체 변이 식별과 같은 응용 분야에서 새로운 생물의학적 발견에 빠르게 중요해지고 있습니다1. 관심 조직에서 이러한 세포 분리를 수행하려면 절개된 조직을 다지고 미세한 세포 여과기를 통해 밀어 넣어 원하는 세포에서 결합 조직을 걸러내야 합니다(그림 1A). 수지상세포나 대식세포와 같은 부착성 세포 유형 또는 특히 섬유질 조직에서 세포를 분리하려면 추가적인 기계적 또는 효소적 분리 단계가 필요합니다 2,3,4. 이 공정은 일반적으로 수동으로 수행되므로 시간이 많이 소요되고 세포 수율과 시료 생존율을 평가할 때 사용자 변동성이 발생하기 쉽습니다. 따라서 자동화된 조직 해리를 위한 맞춤형 옵션을 도입하는 것이 중요합니다. 이러한 시스템을 설계하려는 시도가 있었지만 기존 옵션은 특히 학술 실험실과 자원이 부족한 환경에서 항상 쉽게 접근할 수 있는 것은 아니며, 이는 주로이러한 장치의 비용 부....

프로토콜

이 프로토콜은 UMD IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 7주에서 9주령의 암컷 C57BL/6J 마우스의 조직을 이 연구에 사용했습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).

1. 수동 해리

참고: 이 단계는 Maisel K. et al.7에서 발췌한 것입니다.

  1. 절개된 조직을 제거하고 5% 소 태아 혈청(FBS)이 있는 저온 세포 배양 배지에 넣습니다.
  2. 파편이 치수에서 1mm보다 작아질 때까지 날카로운 해부 가위를 사용하여 조직을 자릅니다.
  3. 다진 조직을 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 배지 5mL를 추가합니다.
  4. 분리되는 조직과 세포 유형에 따라 소화 효소를 추가합니다. 제시된 실험에는 콜라겐분해효소 4(1mg/mL), 콜라겐분해효소 D(1mg/mL) 및 DNase(40μg/mL)를 사용합니다.
  5. 37°C에서 1시간 동안 셰이커 또는 로커에서 배양 내내 부드럽게 교반하면서 배양합니다. 샘플을 위아래로 100회 피펫팅합니다.....

대표적 결과

이 반자동 기계 프로토콜은 세포를 수동으로 처리한 실험의 결과를 복제할 수 있습니다. 이 장치를 사용하여 수동 해리를 통해 준비한 세포 현탁액은 쥐의 폐, 신장 및 심장 조직에서 유사한 세포 수율과 샘플 생존율을 보여줍니다(그림 2A,B). T 세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포의 집단은 분리 프로토콜의 차이에 의해 크게 영향을 받지 않았습니다(

토론

이 장치는 후속 단일 세포 분석을 위해 전체 조직에서 단일 세포 현탁액을 제공하기 위해 연구 환경에서 쉽게 조립할 수 있도록 설계되었습니다. 이러한 기능은 기본적이지만 학술 환경 및 그 밖의 분야에서 연구자의 요구를 충족하기에 충분합니다. 이 장치 사용의 주요 이점은 변동성을 줄임으로써 단세포 현탁액의 준비를 개선할 수 있다는 것입니다. 또한 12+ 시료를 동시에 처리할 수 있는 기능.......

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

Fischell Department of Bioengineering(KM), T32 GM080201(MA), Vogel Endowed Summer Fellowship(MA), LAM Foundation(KM) 및 American Lung Association(KM)에서 자금을 지원받았습니다. 저자는 편집에 도움을 준 Michele Kaluzienski에게 감사의 뜻을 전합니다.

....

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"Acrylic Mega StoreN/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"SimbaLuxSL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)Everbilt1000847413
16 G electrical wire (stranded)Best ConnectionsN/A
2 x 3 mm magnet  SU-CRO0587N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)AEDIKOAE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12GreartisanN/ARated Torque: 2.2 Kg.cm
Reduction Ratio: 1:22
Rated Current: 0.1 A
D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L)
Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L)
Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L)
Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)Mo-guJ19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformerWalfront1A(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)LAFVIN8541582500
Buttons AwpeyePush-button
C57BL6/J mice Jackson Laboratory
Collagenase 4WorthingtonCLS4 LS004188
Collagenase DRoche11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning10-013-CV
DNAseRoche11284932001
Double sided foam tapeSANKAN/A
Double Sided prototyping circuit boarddeyueN/A
EDTASigma- AldrichE7889
Electrical solder and soldering ironLDK1002P
Electrical Tape3M03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco16140089
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
Graphpad PrismGraphPad, La Jolla, CAGraphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inchesSunFounder43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12UxcellN/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12FASN/A
Jumper wires (for Arduino Nano)ELEGOOEL-CP-004
LCD screenJANSANEN/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12Shenzhen
Baishichuangyou
Technology co.Ltd
310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36Still Awakea52400001
Quick disconnect terminal connectorsIEUYO22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)Cell Signaling46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"Shenzhen
Weiyapuhua
Technology
60-026-3

참고문헌

  1. Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).
  2. Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Rittié, L.

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