전동 장치를 사용한 단일 세포 분석을 위한 조직의 기계적 해리

요약

유세포 분석과 같은 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직의 결합된 효소 및 반자동 기계적 해리를 위한 일반 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜을 위해 개발된 저비용 기계 장치의 제조, 조립 및 작동에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

초록

조직 샘플 분석을 위해 단일 세포를 분리하고 준비할 수 있는 능력은 새로운 생물의학 발견 및 연구에 빠르게 중요해지고 있습니다. 단일 세포 분리를 위한 수동 프로토콜은 시간이 많이 걸리고 사용자 변동성이 발생하기 쉽습니다. 자동화된 기계 프로토콜은 처리 시간과 시료 변동성을 줄일 수 있지만 리소스가 부족한 연구 환경에서는 쉽게 접근할 수 없거나 비용 효율적이지 않습니다. 여기에 설명된 장치는 학술 실험실을 위한 저비용 대안으로 상업적으로 이용 가능한 재료를 사용하여 반자동 조직 해리를 위해 설계되었습니다. 장치 설계를 제작, 조립 및 작동하기 위한 지침이 제공되었습니다. 해리 프로토콜은 여러 마우스 조직에서 수동 전처리와 유사한 세포 수율 및 샘플 생존율을 가진 단일 세포 현탁액을 안정적으로 생성합니다. 이 프로토콜은 장치당 최대 12개의 조직 샘플을 동시에 처리할 수 있는 기능을 제공하므로 큰 샘플 크기가 필요한 연구를 보다 쉽게 관리할 수 있습니다. 또한 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하면 다양한 조직과 실험 제약 조건을 수용하기 위해 장치 프로토콜을 사용자 정의할 수 있습니다.

서문

단일 세포 분석은 유세포 분석, 다양한 세포 유형 식별, 단일 세포 염기서열 분석 또는 세포 간 게놈 또는 전사체 변이 식별과 같은 응용 분야에서 새로운 생물의학적 발견에 빠르게 중요해지고 있습니다¹. 관심 조직에서 이러한 세포 분리를 수행하려면 절개된 조직을 다지고 미세한 세포 여과기를 통해 밀어 넣어 원하는 세포에서 결합 조직을 걸러내야 합니다(그림 1A). 수지상세포나 대식세포와 같은 부착성 세포 유형 또는 특히 섬유질 조직에서 세포를 분리하려면 추가적인 기계적 또는 효소적 분리 단계가 필요합니다 ^2,3,4. 이 공정은 일반적으로 수동으로 수행되므로 시간이 많이 소요되고 세포 수율과 시료 생존율을 평가할 때 사용자 변동성이 발생하기 쉽습니다. 따라서 자동화된 조직 해리를 위한 맞춤형 옵션을 도입하는 것이 중요합니다. 이러한 시스템을 설계하려는 시도가 있었지만 기존 옵션은 특히 학술 실험실과 자원이 부족한 환경에서 항상 쉽게 접근할 수 있는 것은 아니며, 이는 주로^{이러한 장치의 비용} 부담으로 인해 5. 더욱이, 이러한 장치들이 항상 연구 그룹의 개별적인 필요에 맞게 맞춤화될 수 있는 것은 아니다⁶.

여기서, 조직 해리기 장치는 소화 효소 및 기계적 파괴의 도움으로 전체 조직 또는 조직 조각의 소화를 단일 세포 현탁액으로 자동화하도록 설계되었습니다. 이 장치는 실험실에서 쉽게 조립할 수 있고, 온도 조절을 위해 가열 또는 냉각 챔버에 배치할 수 있으며, 해리하는 데 필요한 조직 수에 맞게 맞춤화할 수 있으며, 원하는 해리 프로토콜로 프로그래밍할 수 있습니다. 이 장치를 광범위하게 사용하면 세포 추출 프로토콜의 재현성을 크게 개선하고 수동 해리에 대한 시간 절약형 대안을 제공할 수 있습니다.

이 설계는 자동화된 프로세스를 통해 최대 12개의 조직을 동시에 분해할 수 있습니다. 이 장치는 병렬로 연결된 12개의 개별 모터로 구성되며 모터의 회전/속도를 제어하기 위해 조정 가능한 전압 다이얼이 있는 AC/DC 어댑터를 통해 표준 벽면 플러그로 전원이 공급됩니다. 모터는 C-튜브 상단에 꼭 맞는 육각 볼트를 돌립니다. C-튜브는 모터가 고정되는 상단 플레이트에 양쪽으로 고정되는 아크릴 판의 아래쪽 장력에 의해 제자리에 고정됩니다(그림 1B). 모터는 병렬로 배선되어 있기 때문에 주어진 전압에서의 속도는 크게 변하지 않아야 하지만 전압이 일정하게 유지되더라도 부하(장치에 장착된 C-튜브의 수)는 속도에 영향을 미칩니다. 분당 회전수(rpm)를 측정하기 위해 홀 효과 센서와 모터 샤프트 중 하나에 고정 자석을 사용하여 회전 속도계가 통합되었습니다(보충 그림 1). 모터 어레이 구축을 위한 CAD 파일은 보충 코딩 파일 1에 나와 있습니다. 또한 모터에 전달되는 양전하/음전하를 역전시켜 회전 방향을 반전시키는 프로그래밍 가능한 스위치가 포함되어 있습니다. 이러한 모든 기능은 Arduino Nano(보충 코딩 파일 2)에서 코딩된 소프트웨어(Arduino IDE 소프트웨어, 재료 표 참조)를 사용하여 통합됩니다. 연결된 버튼과 LCD 패널(보충 그림 2)을 사용하여 저장된 프로토콜과 사용자 지정 프로토콜을 생성 및 실행하고, 프로토콜의 지정된 시간에 회전 방향을 자동으로 반전하고, 전압(보충 그림 3)을 사용하여 속도를 조정하고, 프로그래밍된 프로토콜을 완료하는 데 남은 현재 모터 속도와 시간을 표시할 수 있습니다(보충 그림 4).

본 연구의 경우, 이 장치를 사용한 기계-효소 조직 해리와 수동 효소 조직 해리를 모두 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비하여 다운스트림 응용 분야를 위해 회수된 세포에서 차이점이 있는 경우 이를 측정했습니다. 세포 제제는 조직당 총 세포 수율과 세포 생존율 비율을 기준으로 평가되었습니다. 유세포 분석은 표면 마커 발현의 전위차를 비교하는 데 사용되었습니다. 데이터는 그래프 및 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 짝을 이루지 않은 Welch t-검정 을 사용하여 표본 크기 n > 4마리의 마우스가 2번의 반복 실험을 나타내는 표본 쌍 또는 그룹을 비교했습니다. 이 장치의 제조 및 조립에 대한 자세한 지침은 보충 파일 1. 이 프로토콜에 필요한 자료는 재료 목차에 나열되어 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 UMD IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 7주에서 9주령의 암컷 C57BL/6J 마우스의 조직을 이 연구에 사용했습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).

1. 수동 해리

참고: 이 단계는 Maisel K. et ^al.7에서 발췌한 것입니다.

1. 절개된 조직을 제거하고 5% 소 태아 혈청(FBS)이 있는 저온 세포 배양 배지에 넣습니다.
2. 파편이 치수에서 1mm보다 작아질 때까지 날카로운 해부 가위를 사용하여 조직을 자릅니다.
3. 다진 조직을 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 배지 5mL를 추가합니다.
4. 분리되는 조직과 세포 유형에 따라 소화 효소를 추가합니다. 제시된 실험에는 콜라겐분해효소 4(1mg/mL), 콜라겐분해효소 D(1mg/mL) 및 DNase(40μg/mL)를 사용합니다.
5. 37°C에서 1시간 동안 셰이커 또는 로커에서 배양 내내 부드럽게 교반하면서 배양합니다. 샘플을 위아래로 100회 피펫팅합니다.
6. EDTA를 추가하여 5mM 농도의 시료 부피를 얻습니다. 샘플을 위아래로 100회 피펫팅한 다음 샘플을 위아래로 100회 세게 피펫팅합니다.
7. 샘플을 70μm 세포 스트레이너에 통과시키고 50mL 또는 15mL 튜브에 수집합니다.
8. 수집된 세포를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 1mL의 적혈구 용해 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 실온에서 1분간 배양합니다.
9. 9mL의 차가운 1X 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하여 용해 완충액을 중화합니다.
10. 수집된 세포를 다시 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 원하는 완충액 또는 배지에 세포를 재현탁시킵니다.

2. 반자동 기계적 해리

1. 절개된 조직을 5% 소 태아 혈청(FBS)이 있는 저온 세포 배양 배지에 넣습니다.
   참고: 이 프로토콜은 고형 조직에서 세포를 분리하기 위한 것입니다.
2. 조직 조각이 치수에 관계없이 약 5mm가 될 때까지 날카로운 해부 가위를 사용하여 조직을 자릅니다. 잘게 썬 조직을 C-튜브에 옮기고 배지 1mL를 추가합니다.
3. C-튜브를 장치에 로드합니다. 튜브 홀더 플레이트(보충 그림 1A)를 D자형 튜브 바닥에 맞춥니다.
4. 텐션 암을 아크릴 플레이트에 래치하여 튜브를 모터 플레이트에 고정합니다(보충 그림 3).
5. 사용자 지정 프로그램 설정: 전진, 30초; 후진, 10초; 루프, 4회.
   1. 파란색 버튼을 눌러 메인 메뉴에서 사용자 지정 모드를 선택합니다.
   2. 첫 번째 사용자 지정 모드 메뉴에서 화면의 값이 30초가 될 때까지 빨간색 버튼을 눌러 정방향 회전 시간을 30초로 지정합니다. 파란색 버튼을 눌러 이 값을 선택하고 다음 메뉴 화면으로 이동합니다.
   3. 두 번째 사용자 지정 모드 메뉴에서 화면의 값이 10초가 될 때까지 빨간색 버튼을 눌러 역회전 지속 시간을 10초로 지정합니다. 파란색 버튼을 눌러 이 값을 선택하고 다음 메뉴 화면으로 이동합니다.
   4. 세 번째 사용자 지정 모드 메뉴에서 화면의 값이 2.5.2X가 될 때까지 빨간색 버튼을 눌러 2.5.2-2.5.3단계에서 설정한 선택을 반복할 횟수를 지정합니다. 파란색 버튼을 눌러 이 값을 선택하고 프로그램을 시작합니다.
      알림: 사용자 지정 프로그램은 장치 메모리에 저장되지 않지만 더 빠른 작동을 위해 사전 설정 프로그램 중 하나로 프로그래밍할 수 있습니다(장치 프로그래밍 지침은 보충 파일 1).
6. 볼륨을 조정하여 200rpm에서 사용자 지정 프로그램 실행tage LCD 화면의 오른쪽 하단 모서리에 계산된 rpm 값이 3(추가 그림 4)이 표시될 때까지 제어 다이얼(보충 그림 4).
7. 분리되는 조직 및 세포 유형에 따라 4mL 배지에 분해 효소를 추가합니다.
   참고: 제시된 실험에는 콜라겐분해효소 4(1mg/mL), 콜라겐분해효소 D(1mg/mL) 및 DNase(40μg/mL)를 사용합니다.
8. C-튜브를 장치에 로드하고 2.3-2.6단계를 반복하여 200rpm에서 다음 프로그램을 실행합니다. 후진, 10초; 루프, 4회.
9. 튜브가 로드된 상태로 장치를 37°C 인큐베이터로 45분 동안 옮깁니다.
10. C-튜브를 장치에 로드하고 2.3-2.6단계를 반복하여 50rpm에서 다음 프로그램을 실행합니다. 후진, 30초; 루프, 9회.
11. EDTA를 추가하여 샘플에서 5mM 농도를 얻습니다.
12. C-튜브를 장치에 로드하고 2.3-2.6단계를 반복하여 100rpm에서 다음 프로그램을 실행합니다. 후진, 10초; 루프, 2회.
13. 70 μm 셀 스트레이너를 통해 샘플을 밀어 넣고 50 mL 또는 15 mL 튜브에 수집합니다.
14. 수집된 세포를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 1mL의 적혈구 용해 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 실온에서 1분간 배양합니다.
15. 9mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 용해 완충액을 중화합니다.
16. 수집된 세포를 다시 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 원하는 완충액 또는 배지에 세포를 재현탁시킵니다.

3. 데이터 분석

1. 그래프 및 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다( 재료 표 참조).
2. 쌍을 이루지 않은 Welch t-검정 을 사용하여 표본 크기 n > 마우스 4마리가 2번의 반복 실험을 나타내는 표본 쌍 또는 그룹을 비교합니다.
   참고: 차이는 (p < 0.05)일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

결과

이 반자동 기계 프로토콜은 세포를 수동으로 처리한 실험의 결과를 복제할 수 있습니다. 이 장치를 사용하여 수동 해리를 통해 준비한 세포 현탁액은 쥐의 폐, 신장 및 심장 조직에서 유사한 세포 수율과 샘플 생존율을 보여줍니다(그림 2A,B). T 세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포의 집단은 분리 프로토콜의 차이에 의해 크게 영향을 받지 않았습니다(

토론

이 장치는 후속 단일 세포 분석을 위해 전체 조직에서 단일 세포 현탁액을 제공하기 위해 연구 환경에서 쉽게 조립할 수 있도록 설계되었습니다. 이러한 기능은 기본적이지만 학술 환경 및 그 밖의 분야에서 연구자의 요구를 충족하기에 충분합니다. 이 장치 사용의 주요 이점은 변동성을 줄임으로써 단세포 현탁액의 준비를 개선할 수 있다는 것입니다. 또한 12+ 시료를 동시에 처리할 수 있는 기능...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3